Según la leyenda, la ciudad de Roma fue fundada en el 753 a. C. a orillas del Tíber, a unos 25 kilómetros (16 millas) del mar en Ostia. La isla Tiberina, en el centro del río entre Trastevere y el antiguo centro de la ciudad, fue el sitio de un importante vado antiguo y más tarde fue puenteado. La leyenda dice que los fundadores de Roma, los hermanos gemelos Rómulo y Remo, fueron abandonados en sus aguas, donde fueron rescatados por la loba Lupa.
El río marcaba el límite entre las tierras de los etruscos. al oeste, los sabinos al este y los latinos al sur. Benito Mussolini, nacido en Romaña, ajustó el límite entre Toscana y Emilia-Romaña, de modo que los manantiales del Tíber se encontraran en Romaña.
El Tíber era de importancia crítica para el comercio y el comercio romanos, ya que los barcos podían llegar hasta 100 kilómetros (60 millas) río arriba; hay pruebas de que se utilizó para enviar grano desde el Val Teverina ya en el siglo V a. C. . Más tarde se utilizó para enviar piedra, madera y productos alimenticios a Roma.
Durante las Guerras Púnicas del siglo III a. C., el puerto de Ostia se convirtió en una base naval clave. Más tarde se convirtió en la base naval más importante de Roma. puerto, donde se importaban trigo, aceite de oliva y vino de las colonias de Roma alrededor del Mediterráneo. También se construyeron muelles a lo largo de t ribera en la propia Roma, bordeando las riberas del río alrededor del área del Campus Martius. Los romanos conectaban el río con un sistema de alcantarillado (la Cloaca Máxima) y con una red subterránea de túneles y otros canales, para llevar su agua al centro de la ciudad.
Los romanos adinerados tenían jardines-parques o «horti» a orillas del río en Roma hasta el siglo I antes de Cristo. Estos pueden haber sido vendidos y desarrollados aproximadamente un siglo después.
La fuerte sedimentación del río dificultó el mantenimiento de Ostia, lo que llevó a los emperadores Claudio y Trajano a establecer un nuevo puerto en Fiumicino en el siglo I ANUNCIO. Construyeron una nueva carretera, la via Portuensis, para conectar Roma con Fiumicino, dejando la ciudad por Porta Portese («la puerta del puerto»). Ambos puertos fueron finalmente abandonados debido a la sedimentación.
Varios papas intentaron mejorar la navegación en el Tíber en los siglos XVII y XVIII, con un dragado extenso que continuó hasta el siglo XIX. El comercio se impulsó durante un tiempo, pero en el siglo XX la sedimentación había hecho que el río solo fuera navegable hasta la propia Roma.
El Tíber fue una vez conocido por sus inundaciones: el Campus Martius es una llanura aluvial y se inundaría regularmente a una profundidad de 2 metros (6 pies 7 pulgadas). El río ahora está confinado entre altos terraplenes de piedra que se iniciaron en 1876. Dentro de la ciudad, las orillas del río están bordeadas por bulevares conocidos como lungoteveri, calles «a lo largo del Tíber».
Porque el río se identifica con Roma , los términos «nadando por el Tíber» o «cruzando el Tíber» han llegado a ser el término taquigráfico protestante para convertirse al catolicismo romano. Esto es más común si la persona que se convierte había sido anglicana, lo que se conoce como «nadar en el Támesis» o «cruzar el Támesis».
En la antigua Roma, los criminales ejecutados eran arrojados al Tiber. Las personas ejecutadas en las escaleras de Gemonia fueron arrojadas al Tíber durante la última parte del reinado del emperador Tiberio. Esta práctica continuó durante siglos. Por ejemplo, el cadáver del Papa Formoso fue arrojado al Tíber después del infame Sínodo del Cadáver celebrado en 897.