Enligt legenden grundades staden Rom år 753 f.Kr. vid stranden av Tibern cirka 25 kilometer från havet vid Ostia. Tiber Island, mitt i floden mellan Trastevere och den antika stadskärnan, var platsen för en viktig forntida ford och överbryggades senare. Legenden säger att Roms grundare, tvillingbröderna Romulus och Remus, övergavs på dess vatten, där de räddades av vargen Lupa.
Floden markerade gränsen mellan etruskernas land. i väster, Sabinerna i öster och latinerna i söder. Benito Mussolini, född i Romagna, justerade gränsen mellan Toscana och Emilia-Romagna så att Tiberns källor skulle ligga i Romagna.
Tibern var kritiskt viktigt för den romerska handeln, eftersom fartyg kunde nå så långt som 100 kilometer uppströms; det finns bevis för att det användes för att transportera spannmål från Val Teverina redan för 5: e århundradet f.Kr. Den användes senare för att transportera sten, timmer och livsmedel till Rom.
Under de puniska krigarna på 3-talet f.Kr. blev hamnen i Ostia en viktig marinbas. Den blev senare Roms viktigaste port, där vete, olivolja och vin importerades från Roms kolonier runt Medelhavet. Kajer byggdes också längs t han flodstranden i själva Rom och kantar flodstränderna runt Campus Martius-området. Romarna anslöt floden med ett avloppssystem (Cloaca Maxima) och med ett underjordiskt nätverk av tunnlar och andra kanaler för att föra dess vatten in i mitten av staden.
Rika romare hade trädgårdsparker eller ”horti” vid stranden av floden i Rom fram till första århundradet f.Kr. Dessa kan ha sålts och utvecklats ungefär ett sekel senare.
Den kraftiga sedimenteringen av floden gjorde det svårt att underhålla Ostia, vilket fick kejsarna Claudius och Trajan att etablera en ny hamn på Fiumicino under 1-talet AD. De byggde en ny väg, via Portuensis, för att ansluta Rom med Fiumicino och lämnade staden av Porta Portese (”hamnporten”). Båda hamnarna övergavs så småningom på grund av siltning.
Flera påvar försökte förbättra navigationen på Tibern på 1600- och 1700-talet, med omfattande muddring fram till 1800-talet. Handeln ökade ett tag men på 1900-talet hade siltning resulterat i att floden bara kunde navigeras så långt som till Rom själv.
Tibern var en gång känd för sina översvämningar – Campus Martius är en flodslätt och skulle regelbundet översvämma till ett djup av 2 meter (6 ft 7 in). Floden är nu begränsad mellan höga stenvallar som började 1876. Inom staden kantas flodstränderna av boulevarder som kallas lungoteveri, gator ”längs Tibern”.
Eftersom floden är identifierad med Rom , har termerna ”simma Tibern” eller ”korsa Tibern” kommit att vara den protestantiska stenografi för att konvertera till romersk katolicism. Detta är vanligast om personen som konverterar hade varit anglikansk, vars omvänd benämns ”simma Themsen” eller ”korsa Themsen”.
I forntida Rom kastades avrättade brottslingar i Tiber. Människor som avrättades vid Gemonian trappor kastades i Tibern under den senare delen av kejsaren Tiberius. Denna praxis fortsatte genom århundradena. Till exempel kastades liket från påven Formosus i Tibern efter den ökända kadavarsynoden som hölls 897.