Hästskokrabbor kallas ibland ”levande fossil” eftersom de har funnits i någon form i mer än 450 miljoner år. Under denna tid har jorden gått igenom flera stora isåldrar, en stor död, bildandet och efterföljande uppbrytning av pangaea, och en asteroidpåverkan som dödade dinosaurierna och det mesta av livet på jorden ännu en gång. Med andra ord har hästskokrabbor verkligen sett en del skit. / p>
Ändå skulle jag anta att några av deras konstigaste upplevelser måste ha kommit under de senaste decennierna, som en av de mjuka kropparna kom efter att dinosaurierna började använda händerna för att skopa hästskokrabbor från havet i massor. Samtida människor dödar inte medvetet hästskokrabborna – precis som tidigare århundraden av bönder som fångade dem för gödsel eller fiskare som använde dem som bete. krabbor är rena från fåglar, viker sina gångjärnsrytor och stickar rostfritt stål elnålarna på en mjuk, svag plats för att få blod. Hästskokrabbblod går blått och ogenomskinligt, som frostskyddsmedel blandat med mjölk.
Och för vad behöver människor exakt blodet från ett levande fossil? Ett slags häxkonst, kan du säga, för det håller bokstavligen människor vid liv. Hästskokrabba är mycket känsligt för toxiner från bakterier. Den används för att testa för kontaminering under tillverkningen av allt som kan komma in i människokroppen: varje skott, varje IV-dropp och varje implanterad medicinsk utrustning.
Den moderna biomedicinska industrin är så beroende av detta blod att försvinnandet av hästskokrabbor omedelbart skulle förstöra det. Och de senaste åren har hästskokrabbor, särskilt i Asien, utsatts för ett antal hot: livsmiljöförlust när havsväggar ersätter stränderna där de gyter, föroreningar, överfiske för användning som mat och bete. Hästskokrabbor som blöder för biomedicinsk användning i USA returneras till havet, men uppskattningsvis 50 000 dör också i processen varje år.
Det finns dock ett annat sätt – ett sätt för modern medicin att utnyttja modern teknik snarare än blodet från ett gammalt djur. En syntetisk ersättning för hästsko-krabba blod har funnits i 15 år. Det här är en berättelse om hur forskare tyst lyckades överträffa miljoner år av evolution, och varför det har tagit resten av världen så lång tid att komma ikapp.
Fler berättelser
Jeak Ling Ding säger att hon ”alltid var en labråtta” – den typ av biolog som hade vita rockar snarare än den som vassade in i lera. Ändå, i mitten av 1980-talet, såg hon sig krama genom leran på jakt efter hästskokrabbor. flodmynningen där de bodde, minns hon på underskattat sätt, var ”inte särskilt luktande alls.”
Ding, tillsammans med sin man och forskning partner Bow Ho, hade kommit till hästskokrabbor kretsligt, och deras slutmål var att göra djuren inte längre nödvändiga i biomedicinsk forskning. Vid den tiden var hon molekylärbiolog vid National University of Singapore och ett sjukhus in vitro-befruktningsavdelning hade kommit till Ding och Ho med ett problem: Deras embryon skulle inte överleva tillräckligt länge – kan det bero på bakteriekontaminering ?
Ett standardtest vid den tiden – och nu – är LAL, som står för limulus amebocytlysat. Limulus hänvisar till Limulus polyphemus, arten av hästskokrabba som är infödd till Nordamerikas atlantkust. Amebocyter avser celler i krabbans blod. Och lysat är det material som frigörs från cellerna när de har ”lyserats” eller brutits. Detta är de saker som är mycket känsliga för bakterietoxiner.
Den första personen som fick reda på detta om LAL var Frederik Bang. Trettio år före Ding – och 9 000 mil bort på Cape Cod – samlade han också hästskokrabbor på stranden. (Av skäl som inte är helt förstådda finns hästskokrabbor bara runt Nordamerikas och Asiens östra kuster.) Bang, en patolog, var intresserad av varelsens primitiva immunförsvar. Han bestämde sig för ett protokoll för att injicera bakterier från havsvatten direkt i hästskokrabbor, vilket får blodet att klumpa sig i ”stränga massor.”
Bang misstänkte att denna koagulering hade ett syfte. Det immobiliserade bakterierna och förseglade resten av hästskokrabba från en invaderande patogen. Spännande blev deras blod till gel även om han kokade bakterieinjektionen i fem eller tio minuter först. Detta borde ha dödat bakterierna och steriliserat den injicerade lösningen. Bang insåg att blodet inte var känsligt för levande bakterier utan för bakterietoxiner som kvarstår även efter sterilisering.
Det mänskliga immunförsvaret kan vara mycket mer sofistikerat än en hästskokrabba, men det reagerar också på dessa toxiner. Läkare insåg detta först i slutet av 1800-talet, där patienter som fick sterila skott ändå kom ned med ”injektionsfeber” eller ”saltlösning.” I värsta fall kan toxinerna orsaka septisk chock och till och med död.
När Bang gjorde denna forskning på 1950-talet var det vanliga sättet att testa bakterietoxiner att injicera ett prov i kaniner. Det krävde att någon kom och kontrollerade kanintemperaturerna var 30: e minut i tre timmar för tecken på feber, vilket skulle föreslå bakteriell kontaminering.
Under mikroskop hade kaninens blodceller också en tendens att klumpa sig samman med toxinet, en likhet som Bang noterade i sitt 1956-dokument om hästsko-krabba-blod. Under det kommande och ett halvt decenniet utformade han och en ung patolog vid namn Jack Levin ett standardiserat sätt att extrahera LAL. Det var dock först 1977 som Food and Drug Administration tillät läkemedelsföretag att ersätta sina stora kolonier av kaniner med LAL-kit. Nu har du helt enkelt lagt till LAL i det testade materialet och vänt flaskan för att se om den blev fast – mycket snabbare och bekvämare. LAL-testet krävde fortfarande användning av djur, men den grymma processen att sticka nålar i djur blev dold och outsourcad till en annan del av försörjningskedjan.
När Ding letade efter hästskokrabbor i Singapore , LAL hade blivit en miljonindustri. En kvart hästsko-krabba-blod är enligt uppgift värt så mycket som $ 15 000 dollar. Och de LAL-kit som hon behövde för att testa kontaminering av IVF-embryon var alldeles för dyra. Ett kit, påminner hon om, kostade 1 000 dollar för henne i Singapore.
Därför funderade hon på att göra sitt eget lysat. Men hästsko-krabba-arten hon studerade i Singapore, Carcinoscorpius rotundicauda, är mycket mindre än atlantiska hästskokrabbor, och de kunde inte blöda mycket utan att dö. Så Ding bestämde sig för att göra ett alternativ till LAL som så småningom inte skulle kräva hästskokrabbor alls.
Vad det skulle kräva var att manipulera DNA. Hennes idé var att skarva hästsko-krabba-genen som ansvarar för LALs toxinjaktförmåga i celler som växer lätt i ett laboratorium, som jäst. Bioteknik som ett fält rörde sig redan i riktning mot rekombinant DNA, vilket innebär att man tar DNA från en art och sätter den i en annan. Några år tidigare 1982 började Eli Lilly sälja humant insulin som odlats i kärl av bakterier.
Ding hade en bra utgångspunkt för sitt LAL-alternativ. Då hade forskare identifierat faktor C, den specifika molekylen i LAL som detekterar bakterietoxiner. Så hon började jaga genen som gör faktor C. Hennes forskargrupp tog celler från hästskokrabbor som de samlade in och blödde dem minimalt. (De försökte också, men misslyckades, att odla hästskokrabbor i ett laboratorium och odla dem genom IVF.)
Hästskokrabba är känslig för bakterietoxiner tyvärr gjorde det också svårt att studera. Toxinerna visar sig vara överallt – i vatten, i provrör, i petriskålar. ”Du måste baka allt bakbart glas på 200 till 220 grader i flera timmar.” säger Ding. De var också tvungna att köpa speciellt vatten som hade behandlats för att vara bakterietoxifritt. Om du inte var försiktig kunde lösningsröret lätt bli gel.
När Ding och Ho äntligen identifierade genen för faktor C, de skarvade den i jäst. Det misslyckades för att medan jästen gjorde faktor C utsöndrade den inte molekylen. ”Jästen var mycket svår att bryta upp. Det var väldigt orent och rörigt, säger hon. De försökte en annan typ av jäst- och däggdjursceller – de misslyckades också. I slutet av 1990-talet deltog Ding och Ho i en kurs i USA och lärde sig om baculovirusvektorsystem. Här används ett virus för att infoga faktorn C i insekttarmceller, vilket gör dem till små fabriker för molekylen. Insekter och hästskor har en gemensam evolutionär släktlinje: De är båda leddjur. Och dessa celler fungerade fantastiskt.
Slutligen, ett och ett halvt decennium efter att hon började, hade Ding ett alternativ till LAL som fungerade utan att skada mer hästsko krabbor. Hon samlade sig i biblioteket för att studera patent och utarbetade ansökan själv. Sedan skickade hon den och väntade på att världen skulle förändras.
Världen förändrades inte, åtminstone inte på hästskokrabborna. Det tog tre år för det första rekombinanta faktor C-testpaketet baserat på Dings patent att komma ut 2003, men även då visade läkemedelsföretagen lite intresse.
Företagen hade ett antal skäl. Det fanns bara en leverantör av satsen, ett företag som idag är en del av det schweiziska kemikalieföretaget Lonza. Läkemedelsföretag var försiktiga med att förlita sig på en enda källa för en så viktig del av tillverkningen. Tänk om något hände med Lonza?Eller drabbade en naturkatastrof dess produktionsanläggning? Företag som blöder krabbor tappar också mycket pengar om faktor C antas allmänt. Av de sex företag med anläggningar för krabbblödning i USA avvisade två intervjuer, ett svarade inte på en intervjuförfrågan och två har praktiskt taget ingen allmän närvaro. Den sjätte är Lonza, som för närvarande säljer både LAL och den rekombinanta faktorn.
Lonza, å sin sida, skyllde på det långsamma upptagandet av regler. I USA säger FDA att företag som utför bakterietoxintester ska följa United States Pharmacopeia, en handbok som innehåller läkemedelsstandarder. I en vägledning från 2012 sa FDA att företagen kunde använda rekombinant faktor C, som inte förekommer i Pharmacopeia, om de genomför sina egna valideringstester. ”Risken är naturligtvis att FDA kanske inte accepterar din validering och att du inte kan föra ut din produkt på marknaden”, säger Lonzas talesman Katrin Hoeck. ”Läkemedelsföretag är riskavvisande.” Det tog branschen decennier att flytta från kaniner till LAL också.
Verkligheten i affärer blev en verklig besvikelse för Ding. ”Vi var bara så ivriga som forskare, så glada att det fungerar,” säger hon. ”Och vi trodde att den rekombinanta faktorn C skulle antas runt om i världen och hästskokrabban skulle räddas.”
Nyligen har dock några saker förändrat den senaste riskbelöningsberäkningen för läkemedelsföretag. För det första är Lonza inte längre ensam leverantör. 2013 blev Hyglos det andra företaget som tillverkade rekombinant faktor C. Kevin Williams, seniorforskare på Hyglos, säger att han ser som en försenad modernisering: Läkemedelsföretag slutade förlita sig på grisar och började tillverka insulin i jäst och bakterieceller för decennier sedan. Varför kan inte samma teknik tillämpas på själva testet som används för att kontrollera att insulin är säkert för injektion?
På den regulatoriska sidan tillsatte Europeiska farmakopén rekombinant faktor C som ett accepterat bakterietoxintest i 2016, vilket banar väg för förändring i USA. Ett antal läkemedelsföretag, särskilt Eli Lilly, har jämfört effektiviteten av rekombinant faktor C och LAL.
Jay Bolden, expert på bakterier toxindetektering hos Eli Lilly, påminner om att Lonza kom i sina laboratorier med det rekombinanta faktor C-kit för mer än ett decennium sedan. Han var fascinerad vid den tiden men ännu inte villig att ta steget. Vändpunkten kom 2013, när Eli Lilly började planera en insulinframställningsanläggning i Kina, där de inhemska hästsko-krabba-arterna har minskat. ”Du skulle kunna höra saker om någon dag att hästskokrabben kan bli begränsad,” säger Bolden. Däremot såg leveranskedjan för rekombinant faktor C säkrare med både Hyglos och Lonza som leverantörer. LAL och faktor C är också jämförbara i kostnad.
Bolden säger att Eli Lilly bestämde sig för att ”rita en linje i sanden”: Alla nya produkter efter en viss tid skulle testas med rekombinant faktor C. Företaget lämnade nyligen sin första ansökan om läkemedel till FDA – galcanezumab för att förhindra migrän – där det slutliga läkemedlet kommer att testas med kvalitet med faktor C. Det har också undersökt användning av rekombinant faktor C under tillverkningsprocessen för att testa vatten och utrustning, som för närvarande står för den stora majoriteten av LAL-användning. Bolden säger att Eli Lilly har lobbat den amerikanska farmakopein för att inkludera rekombinant faktor C.
På torsdag talar Bolden i Cape May, New Jersey, vid ett evenemang organiserat av Revive & Restore, en ideell organisation som är mest känd för sitt arbete med att återuppliva utdöda arter. ”Vårt uppdrag är att använda bioteknik för bevarande”, säger Ryan Phelan, medgrundare och verkställande direktör för Revive & Restore. Phelan träffade Ding först när hon reste till Singapore för en syntetisk -biologikonferens 2017, och hon insåg att hennes forskning om rekombinant faktor C satt perfekt i skärningspunkten mellan bevarande och bioteknik.
Revive & Restore och dess bevarandepartners – New Jersey Audubon, American Littoral Society och Delaware River Keeper Network – valde Cape May-platsen eftersom hästskokrabbor kommer hit varje vår för att leka. Du kan inte längre fånga hästsko krabbor här på grund av deras betydelse för en hotad flyttfågelart som kallas den röda knuten. Dessa fåglar dyker upp här också på våren. Deras vandring är tidsinställd så att fåglar som flyger från Sydamerika till Arktis kan klyfta sig på kaviarliknande hästsko-krabba ägg. Stränderna blir svarta av krabbor, deras hon Det klickar när kvinnor klättrar för att lägga sina ägg och män för att befrukta dem.De röda knutarna klättrar för att äta. De fördubblas nästan i vikt för sin resa till Arktis.
Det är en forntida synkronisering mellan arter, en som började långt innan människor började skörda hästskokrabbor efter blod och kommer förhoppningsvis att hålla länge efter.