Antinfekterande Ophiocordyceps-genom avslöjar en stor mångfald av potentiella beteendemanipulationsgener och en möjlig viktig roll för enterotoxiner

Genomfunktioner

Ophiocordyceps-genomdrag som genereras i denna studie (Tabell 1) samlades med läsningar genererade över olika sekvenseringskörningar med användning av två typer av DNA-bibliotek. Endast körningarna som ledde till läsningar av hög kvalitet användes för montering (se Material och metoder). Contig-montering resulterade i genomstorlekar från 21,91-23,92 miljoner baspar (Mbp) för O. unilateralis s.l. och O. australis s.l. arter. Däremot O. subramanianii s.l. hade en uppskattad genomstorlek på 32,31 Mb. Genförutsägelse gav mellan 7621 och 8629 gener för O. unilateralis- och O. australis-arten. Ophiocordyceps subramanianii s.l. förutspåddes ha 11 275 gener. Dessutom GC-innehåll i O. subramanianii s.l. (dvs. 60,35%) var mycket högre jämfört med de andra Ophiocordyceps-arterna i denna studie (54,66% + / – 1,57%) (Tabell 1).

Vi förbättrade också sammansättningen och genförutsägelsen av det tidigare publicerade genomet av O. unilateralis sl stam SC16a (kompletterande tabell S1), som nu har fått artnamnet O. kimflemingiae 20. Förutom att vara mindre fragmenterad är den nya församlingen mindre än tidigare rapporterat18. Detta beror troligen på en bättre sammansättning av repetitiva regioner, som hittades högst i unilateralis-arten (6,59-6,83%) jämfört med de andra ant-infekterande arterna i denna studie (Tabell 1). Trots den mindre sammansättningsstorleken ökade den nya genförutsägelsen genantalet med 798 gener. Denna ökning orsakas huvudsakligen av förutsägelsen av färre chimärer (dvs. närliggande gener som är felaktigt sammanslagna till en genmodell) med Braker1-pipelinen (data visas inte).

För alla utom ett av de gener som genereras i denna studie informerades genförutsägelse av RNA-Seq-läsningar. För de tidigare rapporterade nordamerikanska unilateralis-arterna O. kimflemingiae användes läsningar som genererades i den tidigare studien18. Genom svårigheter med att odla brasiliansk O. camponoti-rufipedis erhölls inte tillräckligt med material för att generera RNA-Seq-data förutom de DNA-läsningar som behövs för att få ett draggenom. Eftersom både O. kimflemingiae och O. camponoti-rufipedis finns inom samma artkomplex (unilateralis), försökte vi kartlägga den nordamerikanska unilateralis-arten som läses för genomet O. camponoti-rufipedis för att se om de kunde användas för att informera om anteckningar. Men medan 93% av O. kimflemingiae läser kartlagda till sitt eget genom, kartläggs endast 43% till genomet O. camponoti-rufipedis (kompletterande tabell S2). Vi kartlade dessutom läsningarna till en annan publicerad O. unilateralis s.l. genomet, det för O. polyrhachis-furcata 22, för att avgöra om detta skulle vara en mer allmän korsmappningseffekt eller specifik för O. camponoti-rufipedis-genomet. En liknande kartläggning på 41% resulterade. Detta antyder att unilateralis-arter i allmänhet kan vara relativt avlägset besläktade, vilket gör korsmappning för att informera annotering mindre lämplig. För informativa ändamål kartlade vi också australis-arten med varandra (stammar MAP-64 från Brasilien och 1348a från Ghana). Detta resulterade i 71% och 82% korsmappade läsningar jämfört med 86% respektive 97% mappade till sina egna genom (tilläggstabell S2). Detta innebär att arter i australiskomplexet sannolikt är mycket närmare besläktade med varandra än arter inom unilateralis-komplexet.

Ortologiska kluster

Vi gick ut för att undersöka vilka genförutsägelser av de antinfekterande Ophiocordyceps-arterna i denna studie är sannolikt konserverade och delas med andra ascomycetes. Dessutom syftade vi till att upptäcka vilka artsspecifika och ”manipulationsspecifika” specialiseringar som kunde ha ägt rum. Som sådan jämfördes de förutsagda proteomerna för våra fem antinfektionssvampar med de 18 andra ascomycetous svampar. Av dessa arter tio var djurparasiter (två infekterande däggdjur, två infekterande nematoder och sex infekterande insekter) och 13 finns i samma ordning (Hypocreales). Fyra arter tillhörde samma familj (Ophiocordycipitaceae) och två var inom samma släkt (Ophiocordyceps). fylogenetisk rekonstruktion baserad på 67 konserverade gener som finns i var och en av dessa organismer avbildas i fig. 2.

Totalt 51 012 ortologiska kluster inkluderade alla antecknade proteiner av var och en av de 23 ascomycetes som ingår i denna analys (kompletterande data S1). Sammanfattningsstatistik för detta kluster finns i kompletterande figur S1. Vi jämförde överlappning av ortologiska kluster mellan tre artområden: 1) de myrinfekterande svamparna, som omfattade alla fem draggenom som genererades i denna studie, 2) de andra insektsinfekterande svamparna Ophiocordyceps sinensis, Tolypocladium inflatum, både Metarhizium och båda Cordyceps och 3) alla icke-insektsinfekterande ascomyceter, vilka inkluderade andra djurinfekterande, växtinfekterande, svampinfekterande och saprofytiska svampar. Resultaten av denna analys avbildas i Venn-diagrammet i fig. 3a. Därefter utförde vi anrikningsanalyser för funktionella anteckningar av antinfektionsgener som hittades inom de olika överlappande och icke-överlappande delarna av diagrammet. Av de 7 931 ortologiska kluster som hittades inom alla tre artområdena var Gene Ontology (GO) -anteckningar för allmänna biologiska processer signifikant överrepresenterade. Detta antyder, som man kan förvänta sig, att ascomycetes med olika livsstilar använder liknande mekanismer för allmänna processer såsom transkription, translation, proteintransport och signaltransduktion. Gener som förutspåddes koda för (små) utsöndrade proteiner, proteiner med GO-anteckningar för multiorganismprocesser och patogenes, och mer specifikt utsöndrade förmodade enterotoxiner, var dock underrepresenterade. När vi utförde en anrikningsanalys av anteckningar närvarande i ortologiska kluster som bara hittades i den antinfekterande arten (dvs. 6 672 kluster, fig. 3a), hittade vi det motsatta resultatet. GO-anteckningar för (i stort sett samma) generella biologiska processer var signifikant underrepresenterade, medan (små) utsöndrade proteiner, proteiner med GO-anteckningar för multiorganismprocesser och patogenes, och förmodade enterotoxiner var överrepresenterade. Detta antyder att en betydande del av hemligheten hos de myrinfekterande svamparna i denna studie är specifik för dem. Denna specificitet uppträdde delvis på grund av enterotoxiner som ingår i sekretomen och bioaktiva små utsöndrade proteiner (SSP) som kan vara viktiga i svamp-myr-interaktioner. (Små) utsöndrade proteiner var också överrepresenterade bland de kluster som antinfektionssvampar uteslutande delade antingen med andra entomopatogener (262 kluster) eller icke-entomopatogener (449 kluster). Detta indikerar att deras sekretomer också innehåller mer generella entomopatogenspecifika proteiner, liksom proteiner som delas uteslutande med icke-entomopatogena ascomycetes.

Vi undersökte också hur ortologiska kluster, som endast hittades bland de myrinfekterande svamparna, representerades av dessa arter (fig. 3b). Av de totalt 6 672 kluster i denna jämförelse verkade 90,6% vara artsspecifika. Klusteröverlappning var således marginell även om alla arter i denna studie finns inom samma släkte (Ophiocordyceps) och i vissa fall även inom samma artkomplex (O. unilateralis s.l. och O. australis s.l.). Analys av anrikning av funktionella anteckningsvillkor i dessa artsspecifika kluster resulterade åter i överrepresentationer av (små) utsöndrade proteiner. Även om det var marginellt hittades de flesta klusteröverlappningar mellan närmare besläktade arter inom samma komplex (dvs O. australis s.l., 289 kluster och O. unilateralis s.l., 182 kluster Fig. 3b). Även här avslöjade anrikningsanalyser en överrepresentation för (små) utsöndrade proteiner. Således verkar det som att en statistiskt signifikant mängd av svampsekretomen hos dessa antinfektionsarter är antingen komplex eller artsspecifik. Dessutom hittade vi en överrepresentation av patogenicitets GO-termer bland de komplexspecifika ortologiska klusterna. Denna upptäckt kan tillskrivas närvaron av ortologa enterotoxiner i arter inom samma komplex.Endast fyra kluster som inte fanns i någon av de andra ascomyceterna i vår jämförelse delades mellan alla fem myrinfekterande arter (fig. 3b). Ingen av dessa fyra kluster fick en funktionell anteckning, men tre av dem innehöll gener med förutsagda utsöndringssignaler. För tre av de fyra klusterna resulterade en BLASTp-analys av generna mot NCBI-databasen enbart i hypotetiska proteinträffar med den tidigare deponerade versionen av O. kimflemingiae-genomet18. Detta indikerar att dessa kluster verkligen kan representera proteiner som är unika för antinfekterande Ophiocordyceps-arter. Proteinsekvenser inom det fjärde klustret resulterade i träffar med metalloproteaser förutom att återigen anpassa sig till ett hypotetiskt protein från O. kimflemingiae (XA68_3159), (kompletterande tabell S3). Detta kluster kan sålunda innehålla förmodade metalloproteaser som enbart återfinns i genomet hos de antinfekterande svamparterna som undersöks här. Dessutom delades endast två av de kluster som hittades unikt i de myrinfekterande svamparna mellan alla fyra arter som inducerar bitande beteende (Fig. 3b). En BLASTp-analys av generna inom dessa kluster resulterade återigen i hypotetiska proteinträffar med den tidigare avsatta versionen av O. kimflemingiae genomet18 (kompletterande tabell S4). >

Vi analyserade bevarande av kandidatgener associerade med den manipulerade bithändelse som observerats hos infekterade myror. Vi använde tidigare publicerade transkriptomiska data18 och bestämde på nytt differentiellt genuttryck genom att kartlägga data till den nya versionen av genomet O. kimflemingiae. Enligt den tidigare publicerade studien följde vi resonemanget att kandidatgener, involverade i att etablera manipulerat bitande beteende, skulle regleras under denna händelse och snabbt nedregleras igen efter. Som sådan identifierades 547 kandidatgener, vilket är 49 fler än rapporterat i föregående analys18. I linje med de tidigare rapporterade uppgifterna var gener involverade i DNA-replikering, oxidationsreduceringsprocesser, utsöndring och sekundär metabolism överrepresenterade.

Bevarande av kandidatmanipulationsgener analyserades också genom ortolog kluster. Vi jämförde överlappning av ortologa kluster som innehöll dessa kandidatgener, som var signifikant upp- och nedreglerade efter manipulerat bitande beteende i O. kimflemingiae, med tre artområden: 1) de andra myrinfekterande svamparna, som omfattade de fyra nya drag genom som genererades i denna studie, 2) de andra insektsinfekterande svamparna och 3) alla icke-insektsinfekterande ascomyceter som använts för jämförelse tidigare. Resultaten av denna analys visas i Venn-diagrammet i fig. 4. Av kandidatmanipulationsgenerna verkade 78% vara ortologer av gener som finns i alla andra tre artområden (dvs 423 kluster, fig 4). Detta antyder att generna som uttrycks under manipulerad bitning inducerad av O. kimflemingiae inte sannolikt är specifika för manipulation. Bland dessa brett delade gener var CYP och andra oxidationsreduktionsrelaterade funktioner överrepresenterade, liksom gener som kodade för utsöndrade proteiner och proteaser. Olika sekundära metabolismanteckningar (kluster 7,8 och 9) var också överrepresenterade bland dessa mer brett delade ortologa kluster. De omfattade ett tryptofandimetylallyltransferas involverat i ergotalkaloidsyntes, olika cytokromer, små utsöndrade proteiner, en polyketidsyntas (PKS) och en PKS-NRPS (icke-ribosomalt proteinsyntas) hybrid. Bland de kandidatmanipuleringsgener som tycktes vara unika för O. kimflemingiae (dvs. 59 kluster, fig. 4) var endast SSP överrepresenterade. 92% av dessa ”unika” gener fick emellertid ingen funktionell kommentar. När någon annan överlappning med de tre artområdena hittades, var SSPs också överrepresenterade, liksom större utsöndrade proteiner. Av de som endast var närvarande vid antinfektion svampar (dvs. 24 kluster Fig. 4), återigen fick majoriteten (79%) ingen funktionell anteckning. Bland de sju ortologa kluster som fanns i alla insektsinfekterande arter, men inte i andra ascomycetes, fann vi en förmodad, utsöndrat enterotoxin. Detta enterotoxin var närvarande i den bitande beteendeinducerande arten O. kimflemingiae (två ortologer), O. camponoti-rufipedis (1 ortolog), O. subramanianii sl (två ortologer) och O. australis-Ghana (två ortologer) , liksom i O. australis-Brazil och O. sinensis. Dessutom visade en av de två enterotoxinortologerna i O. kimflemingiae ett dramatiskt uttrycksmönster med ett > 3000 gånger upp -reglering under manipulation och en 200-faldig nedreglering efter18. Detta enterotoxin kan således potentiellt vara en viktig nyckelspelare i upprättandet av beteendemanipulation av dessa Ophiocordyceps-arter.

Bevarande av sekundära metabolitkluster

En allmän hypotes är att förändrade värdbeteenden etableras genom utsöndring av sekundära metaboliter förutom större bioaktiva föreningar . Denna hypotes stöds av överrepresentation av vissa kommenterade sekundära metabolitkluster bland gener av O. kimflemingiae som regleras under manipulerat bitande beteende18. När vi undersökte dessa närmare fann vi att generna, inom men också direkt flankerande de kommenterade sekundära metabolitklusterna, följde just detta uttrycksmönster (Fig. 5a). Vi frågade om dessa kluster bevarades bland insektsinfekterande Ophiocordyceps-svampar. Detta skulle föreslå en likhet i användningen av sekundära metaboliter av dessa svampar för att interagera med sina myrvärdar för att fastställa det observerade manipulerade beteendet. Som sådan undersökte vi kommenterade kluster 7,8 och 9 av O. kimflemingiae och deras direkt flankerande gener. Dessa kluster 1) reglerades under manipulerat bitande beteende följt av en betydande nedreglering och 2) delade ortologer med andra ascomycetes (se ovan). För generna inom dessa kluster sökte vi efter homologer (BLASTp-inriktning) och ortologer (ortolog kluster) i de andra fyra antinfekterande svamparna (fig. 5b och kompletterande figur S3). Detta visade att unilateralis-arten organiserade åtminstone några av sina sekundära metabolismrelaterade gener i i stort sett liknande kluster. De andra Ophiocordyceps-arterna hade homologer och ortologer av dessa sekundära metabolismgener utspridda genom deras genom eller innehöll inte alls en kopia (Fig. 5b och kompletterande figur S3). Till exempel innehöll kommenterad kluster 8 i O. kimflemingiae ett tryptofandimetylallyltransferas flankerat av oxidationsreduktionsrelaterade CYP och en gen med en FAD-bindande domän. Detta kluster flankeras direkt av sju gener som följde ett liknande uttrycksmönster (fig. 5a). O. camponoti-rufipedis-genomet hade detta tryptofan-dimetylallyltransferas på ett liknande sätt; flankerad av CYP och en FAD-bindande gen, följt av homologer och ortologer av de angränsande generna (Fig. 5b). O. subramanianii s.l. genomet hade också ett liknande tryptofandimetylallyltransferas. Det flankerades emellertid av icke-homologa / ortologa CYP- och FAD-bindande gener. Faktum är att O. subramanianii s.l. hade homologer / ortologer för dessa gener men de bodde på helt olika konturer, liksom generna precis utanför det kommenterade sekundära metabolitklustret (fig. 5b). Dessutom hade båda australis-arterna inte en ortolog / homolog gen som kodar för detta speciella tryptofandimetylallyltransferas. Faktum är att australis-arten från Ghana inte tycktes innehålla ett förmodat tryptofandimetylallyltransferas alls. Liknande slutsatser kan göras med analys av andra sekundära metabolitkluster (kompletterande figur S3). Kluster 7 och 9 från O. kimflemingiae verkade till stor del jämförbara med kluster 31 respektive 8 från O. camponoti-rufipedis. Ändå var gener associerade med dessa kluster återigen antingen inte närvarande eller spridda över genomerna hos de tre andra antinfektionsarterna.

Fylogeni hos svamp-enterotoxiner

Gener som innehöll en kommenterad enterotoxin PFAM-domän (PF01375) och en utsöndringssignal indikerades som förmodade, utsöndrade enterotoxiner. Tidigare resultat och vår nuvarande studie implicerar att gener som kodar för dessa förmodade enterotoxiner är av betydelse för beteendemaniprerande arter av Ophiocordyceps-svampar.Dessa utsöndrade bakteriliknande toxiner kan potentiellt påverka myrbeteendet genom att störa produktionen av kemosignalmolekyler i värden. Detta demonstrerades för enterotoxiner från bakteriella entomopatogener i könsferomoner från bollsvävar 23,24. De kan dock också fungera som bara dödande föreningar25. Dessutom var en av dessa förmodade enterotoxiner extremt högt uppreglerad endast under den manipulerade bithändelsen18. Denna speciella gen var närvarande i alla antimanipulerande Ophiocordyceps-arter i denna studie, liksom O. australis-Brazil och O. sinensis. Dessutom tycktes de myrinfekterande svamparna ha ett ganska stort antal gener som kodar för dessa patogenicitetsrelaterade proteiner. Andra ascomycetes innehöll i allmänhet antingen mycket färre (dvs. andra entomopatogener, nematodinfekterande svampar och Magnaporthe oryzae) eller inga enterotoxindomänhaltiga gener (dvs. resten av ascomycetes i denna studie). Genomerna hos antinfekterande Ophiocordyceps-arter hade 20–36 förmodade enterotoxiner med O. australis-Ghana (n = 20) med det minsta och O. kimflemingiae (n = 36) med det största antalet. Nematodinfekterande svampar Ophiocordyceps minnesotensis och Drechmeria coniospora innehöll 19 och 25 gener med en enterotoxin PFAM-domän. Andra entomopatogener av ordningen Hypocreales innehöll endast 4–16 enterotoxinanteckningar med Metarhizium robertsii och Cordyceps bassiana som mest (n = 16 respektive n = 14). De andra ascomycete-genomerna i denna studie hade inga gener som kodar enterotoxin, förutom växtpatogenen M. oryzae, som innehöll sex.

Vi byggde ett fylogenetiskt träd baserat på alla svampgener i denna studie som innehöll PF01375 värmelabilt alfa-kedjedomän för enterotoxin. Enterotoxiner har oftast rapporterats för bakteriearter (t.ex. ref 23,24,25). Vi inkluderade därför också fyra bakteriella enterotoxiner. Detta resulterade i ett träd baserat på 252 domänregioner. Vi bestämde först hur enterotoxinerna från bakterie- och växtinfekterande arter (dvs. M. oryzae) skulle kluster i förhållande till majoriteten av djurinfekterande arter (dvs. insekts- och nematodinfekterande svampar). Detta placerade tre bakteriella enterotoxiner i en klad och den fjärde i en separat klad (kompletterande figur S4). Ett bakteriellt enterotoxin, från Leptospira mayottensis, bildade en utgrupp för den växtinfekterande M. oryzae-kladen. M. oryzae bor utanför ordningen Hypocreales. Som sådan användes de växtpatogena enterotoxinerna hos denna art som en utgrupp och trädet rotade på L. mayottensis (kompletterande figur S4). Detta träd visade att vissa enterotoxiner från antinfektionssvampar är relaterade till andra insekts- eller nematodinfekterande arter. Andra enterotoxiner bildade sina egna klader. Inom dessa myrinfektionsspecifika klader parades ofta enterotoxiner från de två unilateralis komplexa arterna eller australis komplexa arterna. Ophiocordyceps subramanianii s.l. enterotoxiner bildade ofta utgruppen till en ensidig eller australis-specifik klad (kompletterande figur S4). Dessutom bodde enterotoxinet som var mycket uppreglerat under manipulerat bitande beteende (dvs. GeneID Ophio5 | 373 kompletterande figur S4), samt konserverat bland alla antinfektionsarter i denna studie (och O. sinensis, se ovan). inom en klad som endast innehöll myrmanipulerande arter. Detta indikerar att detta speciella enterotoxin verkligen kan vara av avgörande betydelse för att fastställa manipulerat beteende som observerats hos de arter som ingår i denna studie.