Genomii Ophiocordyceps care infectează furnicile dezvăluie o diversitate ridicată de gene potențiale de manipulare comportamentală și un posibil rol major pentru enterotoxine

Caracteristici ale genomului

Genomi de schiță Ophiocordyceps generate în acest studiu (Tabelul 1) au fost asamblate cu citiri generate pe diferite runde de secvențiere utilizând două tipuri de biblioteci ADN. Pentru asamblare au fost folosite doar cursele care au condus la citiri de înaltă calitate (consultați Materiale și metode). Asamblarea Contig a dus la dimensiuni ale genomului variind de la 21,91-23,92 milioane de perechi de baze (Mbp) pentru O. unilateralis s.l. și O. australis s.l. specii. În contrast, O. subramanianii s.l. avea o dimensiune estimată a genomului de 32,31 Mb. Predicția genelor a dat între 7.621 și 8.629 gene pentru speciile O. unilateralis și O. australis. Ophiocordyceps subramanianii s.l. a fost prezis să aibă 11.275 de gene. În plus, conținutul GC din O. subramanianii s.l. (adică 60,35%) a fost mult mai mare comparativ cu celelalte specii de Ophiocordyceps din acest studiu (54,66% + / – 1,57%) (Tabelul 1).

De asemenea, am îmbunătățit asamblarea și predicția genică a genomului O. publicat anterior. unilateralis sl tulpina SC16a (tabelul suplimentar S1), care a primit acum numele speciei O. kimflemingiae 20. Pe lângă faptul că este mai puțin fragmentată, noul ansamblu este mai mic decât raportat anterior18. Acest lucru se datorează cel mai probabil unei asamblări mai bune a regiunilor repetitive, care au fost găsite cel mai mult la speciile unilateralis (6,59-6,83%) comparativ cu alte specii care infectează furnicile din acest studiu (Tabelul 1). În ciuda dimensiunii mai mici a ansamblului, noua predicție a genei a crescut numărul de gene cu 798 de gene. Această creștere este cauzată în principal de predicția de mai puține himere (adică gene vecine care sunt fuzionate incorect într-un singur model de gene) folosind conducta Braker1 (datele nu sunt prezentate).

Pentru toți genomii, cu excepția unuia, generați în în acest studiu, predicția genică a fost informată de citește ARN-Seq. Pentru speciile unilateralis nordamericane O. kimflemingiae raportate anterior, au fost utilizate citirile generate în acel studiu18. Prin dificultăți în cultivarea O. camponoti-rufipedis brazilian, nu s-a obținut suficient material pentru a genera date ARN-Seq în plus față de citirile ADN necesare pentru a obține un proiect de genom. Deoarece atât O. kimflemingiae cât și O. camponoti-rufipedis se află în același complex de specii (unilateralis), am încercat cartografierea speciilor unilateralis din America de Nord citește genomului O. camponoti-rufipedis pentru a vedea dacă ar putea fi utilizate pentru a informa adnotarea. Cu toate acestea, în timp ce 93% din O. kimflemingiae citește cartografiat la propriul genom, doar 43% cartografiat la genomul O. camponoti-rufipedis (Tabelul suplimentar S2). În plus, am cartografiat citirile la un alt O. unilateralis publicat s.l. genomului, cel al O. polyrhachis-furcata 22, pentru a determina dacă acesta ar fi un efect de mapare încrucișată mai general sau specific genomului O. camponoti-rufipedis. A rezultat o cartografiere similară de 41%. Acest lucru sugerează că speciile unilateralis ar putea fi, în general, destul de îndepărtate, făcând o mapare încrucișată pentru a informa adnotarea mai puțin potrivită. În scop informativ, am cartografiat și speciile australis între ele (tulpini MAP-64 din Brazilia și 1348a din Ghana). Acest lucru a dus la 71% și 82% citiri încrucișate comparativ cu 86% și 97% cartografiate la propriile lor genomi, respectiv (Tabelul suplimentar S2). Aceasta implică faptul că speciile din complexul australis sunt, prin urmare, probabil mult mai strâns legate între ele decât speciile din complexul unilateralis.

Clusters ortologi

Ne-am propus să investigăm care predicții genetice speciile Ophiocordyceps care infectează furnicile din acest studiu sunt probabil conservate și împărtășite cu alte ascomicete. În plus, ne-am propus să descoperim ce specializări specifice speciei și „specifice manipulării” ar fi putut avea loc. Ca atare, proteomii preziși ai celor cinci ciuperci care infectează furnici au fost comparați cu cei ai altor 18 ciuperci ascomicetice. au fost paraziți de animale (două mamifere infectante, doi nematodi infectanți și șase insecte infectante) și 13 locuiesc în aceeași ordine (Hypocreales). reconstrucția filogenetică bazată pe 67 de gene conservate prezente în fiecare dintre aceste organisme este descrisă în Fig. 2.

Un total de 51.012 clustere ortologice au inclus toate proteinele adnotate din fiecare dintre cele 23 de ascomicete incluse în această analiză (date suplimentare S1). Statisticile sumare referitoare la acest grup pot fi găsite în figura suplimentară S1. Am comparat suprapunerea grupurilor ortologice între trei specii: 1) ciupercile care infectează furnicile, care cuprindeau toate cele cinci genome de proiect generate în acest studiu, 2) celelalte ciuperci infectante cu insecte Ophiocordyceps sinensis, Tolypocladium inflatum, ambele Metarhizium și ambele specii Cordyceps și 3) toate ascomicetele care nu infectează insecte, care au inclus și alte ciuperci care infectează animale, infectează plante, infectează ciuperci și saprofite. Rezultatele acestei analize sunt prezentate în Diagrama Venn din Fig. 3a. Ulterior, am efectuat analize de îmbogățire pentru adnotările funcționale ale genelor speciilor care infectează furnici, care au fost găsite în diferitele părți suprapuse și care nu se suprapun ale diagramei. Dintre cele 7.931 de grupuri ortologice care au fost găsite în toate cele trei specii, adnotările genologice ontologice (GO) pentru procesele biologice generale au fost supra-reprezentate în mod semnificativ. Acest lucru sugerează, așa cum ne-am aștepta, că ascomicetele cu stiluri de viață diferite folosesc mecanisme similare pentru procesele generale, cum ar fi transcrierea, traducerea, transportul proteinelor și transducția semnalului. Cu toate acestea, genele prezise pentru a codifica proteinele secretate (mici), proteinele cu adnotări GO pentru procesele multi-organism și patogeneza și, mai precis, enterotoxinele putative secretate, au fost subreprezentate. Într-adevăr, atunci când am efectuat o analiză de îmbogățire a adnotărilor prezente în clustere ortologe care au fost găsite doar în speciile care infectează furnici (adică 6.672 clustere, Fig. 3a), am găsit rezultatul opus. Adnotările GO pentru (în mare parte aceleași) procese biologice generale au fost semnificativ subreprezentate, în timp ce proteinele secretate (mici), proteinele cu adnotările GO pentru procesele multi-organism și patogeneza și enterotoxinele putative au fost supra-reprezentate. Acest lucru sugerează că o parte semnificativă a secretomei fungilor care infectează furnicile din acest studiu este specifică acestora. Această specificitate a apărut parțial datorită enterotoxinelor care fac parte din proteinele secretate mici și bioactive secretate (SSP) care ar putea fi importante în interacțiunile fungice-furnice. Proteinele secretate (mici) au fost, de asemenea, supra-reprezentate printre grupurile pe care ciupercile infectante le împart în exclusivitate fie cu alți entomopatogeni (262 de grupuri), fie cu non-entomopatogeni (449 de grupuri). Acest lucru indică faptul că secretomii lor conțin, de asemenea, proteine specifice general entomopatogenului, precum și proteine care sunt partajate exclusiv cu ascomicetele neentomopatogene.

m examinat, de asemenea, modul în care grupurile ortologice, care au fost găsite doar printre ciupercile care infectează furnicile, au fost reprezentate de acele specii (Fig. 3b). Din totalul de 6.672 de clustere din această comparație, 90,6% par să fie specifice speciei. Suprapunerea clusterului a fost, astfel, marginală, chiar dacă toate speciile din acest studiu se află în același gen (Ophiocordyceps) și, în unele cazuri, chiar în cadrul aceluiași complex de specii (O. unilateralis s.l. și O. australis s.l.). Analizând îmbogățirea termenilor funcționali de adnotare în aceste grupuri specifice speciilor a rezultat din nou în supra-reprezentări ale proteinelor secretate (mici). Deși marginală, cele mai multe suprapuneri de grupuri s-au găsit între specii mai strâns legate în cadrul aceluiași complex (adică O. australis s.l., 289 de grupuri și O. unilateralis s.l., 182 de grupuri Fig. 3b). Tot aici, analizele de îmbogățire au relevat o supra-reprezentare a proteinelor secretate (mici). Astfel, se pare că o cantitate semnificativă statistic din secretomul fungic al acestor specii care infectează furnicile este fie complexă, fie specifică speciei. În plus, am găsit o supra-reprezentare a termenilor GO de patogenitate printre grupurile ortologice complexe-specifice. Această constatare ar putea fi atribuită prezenței enterotoxinelor ortoloage la specii din același complex.Doar patru grupuri care nu au fost prezente în niciunul dintre celelalte ascomicete din comparația noastră au fost împărțite între toate cele cinci specii care infectează furnici (Fig. 3b). Niciunul dintre aceste patru grupuri nu a primit o adnotare funcțională, dar trei dintre ele conțineau gene cu semnale de secreție prezise. Pentru trei din cele patru clustere, o analiză BLASTp a genelor împotriva bazei de date NCBI a avut ca rezultat doar rezultate ipotetice ale proteinelor cu versiunea depusă anterior a genomului O. kimflemingiae18. Acest lucru indică faptul că aceste grupuri ar putea reprezenta într-adevăr proteine care sunt unice speciilor de Ophiocordyceps care infectează furnicile. Secvențele de proteine din cadrul celui de-al patrulea grup au avut ca rezultat lovituri cu metaloproteazele, pe lângă alinierea din nou cu o proteină ipotetică din O. kimflemingiae (XA68_3159), (Tabelul suplimentar S3). Acest grup ar putea conține astfel metaloproteaze putative care se găsesc exclusiv în genomul speciilor fungice care infectează furnicile examinate aici. Mai mult, doar 2 dintre grupurile găsite în mod unic în ciupercile care infectează furnica au fost împărțite între toate cele patru specii care induc un comportament mușcător (Fig. 3b). O analiză BLASTp a genelor din aceste grupuri a dus din nou la lovituri ipotetice de proteine cu versiunea depusă anterior a genomului O. kimflemingiae18 (Tabelul suplimentar S4).

Gene de manipulare ale candidaților implicate în stabilirea comportamentului de mușcare

Am analizat conservarea genelor candidate asociate cu evenimentul mușcător manipulat observat la furnicile infectate. Am folosit date transcriptomice publicate anterior18 și am redefinit expresia diferențială a genelor prin maparea datelor la noua versiune a genomului O. kimflemingiae. Conform studiului publicat anterior, am urmat raționamentul că genele candidate, implicate în stabilirea unui comportament de mușcătură manipulat, ar fi reglate în sus în timpul acestui eveniment și rapid reglate în jos, după aceea. Ca atare, au fost identificate 547 de gene candidate, ceea ce este cu 49 mai mult decât raportat în analiza anterioară18. În conformitate cu datele raportate anterior, genele implicate în replicarea ADN-ului, procesele de reducere a oxidării, secreția și metabolismul secundar au fost supra-reprezentate.

Conservarea genelor de manipulare candidate a fost, de asemenea, analizată prin grupare ortologă. Am comparat suprapunerea de grupuri ortologe care conțin acele gene candidate, care au fost semnificativ în sus și în timpul reglării în jos după comportamentul de mușcătură manipulat în O. kimflemingiae, cu trei game de specii: 1) celelalte ciuperci care infectează furnicile, care au cuprins cele patru noi proiecte genomurile generate în acest studiu, 2) celelalte ciuperci care infectează insectele și 3) toate ascomicetele care nu infectează insectele utilizate pentru comparație mai devreme. Rezultatele acestei analize sunt prezentate în Diagrama Venn din Fig. 4. Dintre genele de manipulare candidate, 78% păreau a fi ortologi ai genelor prezente în toate celelalte trei game de specii (adică 423 clustere, Fig. 4). Aceasta implică faptul că genele exprimate în timpul mușcăturii manipulate induse de O. kimflemingiae nu sunt probabil specifice manipulării. Printre aceste gene în general împărtășite, CYP-urile și alte funcții legate de reducerea oxidării au fost supra-reprezentate, precum și gene care codifică proteine secretate și proteaze. Diferite adnotări ale metabolismului secundar (grupurile 7,8 și 9) au fost, de asemenea, supra-reprezentate printre aceste grupuri ortologice mai larg împărtășite. Acestea cuprindeau o triptofan dimetilaliltransferază implicată în sinteza alcaloidului de ergot, diferiți citocromi, proteine mici secretate, o polichetid sintază (PKS) și un hibrid PKS-NRPS (proteină sintetază non-ribozomală). Dintre genele de manipulare candidate care păreau a fi unice pentru O. kimflemingiae (adică 59 de clustere, Fig. 4), numai SSP-urile au fost supra-reprezentate. Cu toate acestea, 92% din aceste gene „unice” nu au primit o adnotare funcțională. În cazul în care s-a găsit orice altă suprapunere cu cele trei game de specii, SSP-urile au fost, de asemenea, supra-reprezentate, la fel ca și proteinele secretate mai mari. ciuperci (adică 24 de clustere Fig. 4), din nou majoritatea (79%) nu au primit o adnotare funcțională. Dintre cele șapte clustere ortologe care erau prezente în toate speciile care infectau insectele, dar nu și în alte ascomicete, am găsit un putativ, enterotoxină secretată. Această enterotoxină a fost prezentă în speciile care induc comportamentul mușcător O. kimflemingiae (doi ortologi), O. camponoti-rufipedis (1 ortolog), O. subramanianii sl (doi ortologi) și O. australis-Ghana (doi ortologi) , precum și în O. australis-Brazilia și O. sinensis. Mai mult, unul dintre cei doi ortologi enterotoxinici din O. kimflemingiae a arătat un model de expresie dramatic cu un > de 3.000 de ori în sus -regulare în timpul manipulării și o reglare descendentă de 200 de ori după18. Această enterotoxină ar putea fi, așadar, potențial un jucător cheie important în stabilirea manipulării comportamentale de către aceste specii de Ophiocordyceps.

Conservarea grupurilor de metaboliți secundari

O ipoteză generală este că comportamentele modificate ale gazdei sunt stabilite prin secreția de metaboliți secundari pe lângă compuși bioactivi mai mari . Această ipoteză este susținută de supra-reprezentarea anumitor grupuri de metaboliți secundari adnotați printre genele O. kimflemingiae care sunt reglate în sus în timpul comportamentului de mușcare manipulat18. Examinându-le mai îndeaproape, am constatat că, într-adevăr, genele, în interiorul, dar și direct flancând grupurile de metaboliți secundari adnotați, au urmat acest model de expresie special (Fig. 5a). Am întrebat dacă aceste grupuri au fost conservate printre fungii Ophiocordyceps care infectează insectele. Acest lucru ar sugera o similaritate în utilizarea metaboliților secundari de către acești ciuperci pentru a interacționa cu gazdele furnicilor lor pentru a stabili comportamentele manipulate observate. Ca atare, am examinat grupurile adnotate 7,8 și 9 de O. kimflemingiae și genele lor direct flancante. Aceste grupuri 1) au fost reglate în sus în timpul comportamentului de mușcătură manipulat, urmate de o reglare semnificativă în jos, și 2) au împărțit ortologii cu alți ascomiceti (vezi mai sus). Pentru genele din aceste grupuri, am căutat omologi (aliniere BLASTp) și ortologi (grupare ortologă) în celelalte patru ciuperci care infectează furnicile (Fig. 5b și Figura Suplimentară S3). Acest lucru a demonstrat că speciile unilateralis au organizat cel puțin unele dintre genele lor secundare legate de metabolism în grupuri în mare măsură similare. Celelalte specii de Ophiocordyceps aveau omologi și ortologi ai acestor gene de metabolism secundar împrăștiate prin genomul lor sau nu conțineau deloc o copie (Fig. 5b și Figura Suplimentară S3). De exemplu, clusterul adnotat 8 din O. kimflemingiae conținea o triptofan dimetilaliltransferază flancată de CYP-uri legate de reducerea oxidării și o genă cu un domeniu de legare FAD. Acest cluster este direct flancat de șapte gene care au urmat un model similar de expresie (Fig. 5a). Genomul O. camponoti-rufipedis avea această triptofan dimetilaliltransferază într-un mod similar; flancat de CYP-uri și o genă de legare FAD, urmată de omologi și ortologi ai genelor vecine (Fig. 5b). O. subramanianii s.l. genomul avea, de asemenea, o triptofan dimetilaliltransferază similară. Cu toate acestea, a fost însoțit de gene care nu se omologă / ortologă și care leagă FAD. De fapt, O. subramanianii s.l. au avut omologi / ortologi ai acestor gene, dar au locuit pe contigs complet diferiți, la fel ca genele chiar în afara grupului de metaboliți secundari adnotați (Fig. 5b). Mai mult, ambele specii australiene nu aveau o genă ortologă / omologă care codifică această triptofan dimetilaliltransferază. De fapt, speciile australis din Ghana nu păreau să conțină deloc o triptofan dimetilaliltransferază. Concluzii similare ar putea fi făcute analizând celelalte grupuri de metaboliți secundari (Figura suplimentară S3). Clusterele 7 și 9 din O. kimflemingiae păreau în mare măsură comparabile cu grupurile 31 și respectiv din O. camponoti-rufipedis. Cu toate acestea, genele asociate cu aceste grupuri nu au fost din nou prezente sau împrăștiate pe genomul celorlalte trei specii care infectează furnici.

Filogenia enterotoxinelor fungice

Genele care conțineau un domeniu enterotoxin adnotat PFAM (PF01375) și un semnal de secreție au fost indicate ca enterotoxine putative, secretate. Rezultatele anterioare și studiul nostru actual implică faptul că genele care codifică aceste supuse enterotoxine sunt importante în speciile de ciuperci Ophiocordyceps care manipulează comportamentul.Aceste toxine secretate de tip bacterian ar putea afecta potențial comportamentul furnicilor prin interferența cu producția de molecule de semnalizare chimică în gazdă. Acest lucru a fost demonstrat pentru enterotoxinele de la entomopatogenii bacterieni din feromonii sexuali ai gărgărițelor bolii23,24. Totuși, acestea ar putea funcționa și ca simple compuși de ucidere25. În plus, una dintre aceste enterotoxine supuse a fost extrem de puternic reglată în sus doar în timpul evenimentului de mușcătură manipulat18. Această genă specială a fost prezentă în toate speciile Ophiocordyceps manipulatoare de furnici în acest studiu, precum și în O. australis-Brazilia și O. sinensis. Mai mult, ciupercile care infectează furnica par să aibă un număr destul de mare de gene care codifică aceste proteine legate de patogenitate. Alte ascomicete conțin, în general, fie mult mai puține (adică alți entomopatogeni, ciuperci care infectează nematodele și Magnaporthe oryzae), fie nu au gene care conțin domenii enterotoxine (adică restul ascomicetelor din acest studiu). Genomul speciilor Ophiocordyceps care infectează furnicile au avut 20–36 enterotoxine supuse, cu O. australis-Ghana (n = 20) având cel mai mic și O. kimflemingiae (n = 36) având cel mai mare număr. Ciupercile infectante cu nematode Ophiocordyceps minnesotensis și Drechmeria coniospora conțineau 19 și 25 de gene cu un domeniu enterotoxin PFAM. Alți entomopatogeni din ordinul hipocreaților conțineau doar 4-16 adnotări enterotoxine cu Metarhizium robertsii și Cordyceps bassiana având cel mai mult (n = 16 și respectiv n = 14). Celelalte genomi ascomicete din acest studiu nu au avut gene care codifică enterotoxinele, cu excepția agentului patogen al plantei M. oryzae, care conținea șase.

Am construit un arbore filogenetic bazat pe toate genele fungice din acest studiu care conținea domeniul lanțului alfa al enterotoxinei labil termic PF01375. Enterotoxinele au fost raportate în cea mai mare parte pentru speciile bacteriene (de exemplu, referințele 23,24,25). Prin urmare, am inclus și patru enterotoxine bacteriene. Acest lucru a dus la un arbore bazat pe 252 de regiuni de domeniu. Am stabilit mai întâi modul în care enterotoxinele speciilor care infectează bacteriile și plantele (adică M. oryzae) s-ar grupa față de majoritatea speciilor care infectează animalele (adică ciupercile care infectează insectele și nematodele). Aceasta a plasat trei enterotoxine bacteriene într-o singură cladă, iar a patra într-o cladă separată (Figura suplimentară S4). O enterotoxină bacteriană, de la Leptospira mayottensis, a format un grup pentru clada M. oryzae care infectează plantele. M. oryzae se află în afara ordinii hipocreale. Ca atare, enterotoxinele patogene ale plantei din această specie au fost utilizate ca grup outgroup și arborele a fost înrădăcinat pe L. mayottensis (Figura suplimentară S4). Acest copac a arătat că unele enterotoxine ale ciupercilor care infectează furnicile sunt legate de cele ale altor specii care infectează insecte sau nematode. Alte enterotoxine și-au format propriile clade. În cadrul acestor clade specifice infecției furnicilor, enterotoxinele din cele două specii complexe unilateralis sau din speciile complexului australis au fost adesea împerecheate. Ophiocordyceps subramanianii s.l. enterotoxinele au format adesea grupul exterior al unei clade specifice unilateralis sau australis (Figura suplimentară S4). În plus, enterotoxina care a fost foarte bine reglată în timpul comportamentului de mușcare manipulat (adică GeneID Ophio5 | 373 Figura suplimentară S4), precum și conservată în rândul tuturor speciilor care infectează furnicile din acest studiu (și O. sinensis, vezi mai sus), a locuit într-o cladă care conținea doar specii manipulatoare de furnici. Acest lucru indică faptul că această anumită enterotoxină ar putea avea într-adevăr o importanță cheie în stabilirea unui comportament manipulat, așa cum sa observat la speciile incluse în acest studiu.