Os caranguejos-ferradura são às vezes chamados de “fósseis vivos” porque existem de alguma forma há mais de 450 milhões de anos. Neste tempo, a Terra existiu passou por várias eras glaciais importantes, uma Grande Morte, a formação e subsequente desintegração de Pangéia e um impacto de asteróide que matou os dinossauros e a maior parte da vida na Terra novamente. Em outras palavras, os caranguejos-ferradura realmente viram alguma merda.
No entanto, eu conjeturo, algumas de suas experiências mais estranhas devem ter ocorrido nas últimas décadas, como um dos mamíferos de corpo mole que veio depois que os dinossauros começaram a usar as mãos para retirar caranguejos-ferradura em massa do oceano. Os humanos contemporâneos não matam deliberadamente os caranguejos-ferradura, como faziam os séculos anteriores de agricultores que os pegavam para fertilizar ou pescadores que os usavam como isca. Em vez disso, eles esfregam os caranguejos limpos de cracas, dobrar suas carapaças com dobradiças e colar aço inoxidável el agulhas em um ponto fraco e macio, a fim de tirar sangue. O sangue do caranguejo-ferradura corre azul e opaco, como anticongelante misturado com leite.
E para que exatamente os humanos precisam do sangue de um fóssil vivo? Uma espécie de bruxaria, você poderia dizer, pois literalmente mantém as pessoas vivas. O sangue do caranguejo-ferradura é extremamente sensível às toxinas das bactérias. É usado para testar a contaminação durante a fabricação de qualquer coisa que possa entrar no corpo humano: cada injeção, cada soro intravenoso e cada dispositivo médico implantado.
A indústria biomédica moderna é tão dependente desse sangue que o desaparecimento dos caranguejos-ferradura a paralisaria instantaneamente. E nos últimos anos, os caranguejos-ferradura, principalmente na Ásia, passaram por uma série de ameaças: perda de habitat à medida que os paredões substituem as praias onde desovam, poluição, pesca excessiva para uso como alimento e isca. Caranguejos-ferradura sangrados para uso biomédico nos Estados Unidos são devolvidos ao oceano, mas cerca de 50.000 também morrem no processo todos os anos.
Mas há outra maneira – uma maneira da medicina moderna fazer uso de tecnologia moderna em vez do sangue de um animal antigo. Um substituto sintético para o sangue do caranguejo-ferradura está disponível há 15 anos. Esta é uma história sobre como os cientistas silenciosamente conseguiram superar milhões de anos de evolução e por que o resto do mundo demorou tanto para alcançá-la.
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Jeak Ling Ding diz que “sempre foi um rato de laboratório” – o tipo de bióloga que usava jaleco branco em vez do tipo que entrava na lama. No entanto, em meados da década de 1980, ela se viu esmagando a lama em busca de caranguejos-ferradura. estuário onde eles viviam, ela lembra de forma sutil, “não tinha um cheiro muito doce”.
Ding, junto com seu marido e a pesquisa Seu parceiro Bow Ho, passara por caranguejos-ferradura indiretamente e seu objetivo final era fazer com que os animais não fossem mais necessários na pesquisa biomédica. Na época, ela era bióloga molecular na Universidade Nacional de Cingapura, e o departamento de fertilização in vitro de um hospital veio a Ding e Ho com um problema: seus embriões não sobreviveriam por tempo suficiente – poderia ser por causa da contaminação bacteriana ?
Um teste padrão na época – e agora – é LAL, que significa lisado de amebócito limulus. Limulus refere-se a Limulus polyphemus, a espécie de caranguejo-ferradura nativa da costa atlântica da América do Norte. Amebócito refere-se às células do sangue do caranguejo. E lisado é o material liberado das células uma vez que elas tenham sido “lisadas” ou quebradas. Esse material é extremamente sensível a toxinas bacterianas.
A primeira pessoa a descobrir isso sobre LAL foi Frederik Bang. Trinta anos antes de Ding – e a 9.000 milhas de distância em Cape Cod – ele também estava coletando caranguejos-ferradura na costa. (Por razões não totalmente compreendidas, os caranguejos-ferradura só são encontrados nas costas orientais da América do Norte e da Ásia.) Bang, um patologista, estava interessado no sistema imunológico primitivo da criatura. Ele estabeleceu um protocolo de injeção de bactérias da água do mar diretamente em caranguejos-ferradura, que fazem com que seu sangue se aglomere em “massas pegajosas”.
Bang suspeitou que essa coagulação tinha um propósito. Ele imobilizou a bactéria, isolando o resto do corpo do caranguejo-ferradura de um patógeno invasor. Curiosamente, o sangue deles se transformou em gel, mesmo que ele fervesse a injeção de bactérias por cinco ou dez minutos primeiro. Isso deve ter eliminado as bactérias e esterilizado a solução injetada. Bang percebeu que o sangue era sensível não apenas a bactérias vivas, mas também a toxinas bacterianas que persistem mesmo após a esterilização.
O sistema imunológico humano pode ser muito mais sofisticado do que o do caranguejo-ferradura, mas também reage a essas toxinas. Os médicos perceberam isso pela primeira vez no final do século 19, quando os pacientes que receberam vacinas estéreis, no entanto, contraíram “febre da injeção” ou “febre salina” Nos piores casos, as toxinas podem causar choque séptico e até morte.
Na época em que Bang estava fazendo essa pesquisa, na década de 1950, a maneira padrão de testar as toxinas bacterianas era injetar uma amostra em coelhos. Era necessário que alguém verificasse as temperaturas dos coelhos a cada 30 minutos por três horas em busca de sinais de febre, o que sugeriria contaminação bacteriana.
Sob o Ao microscópio, as células do sangue do coelho também tinham tendência a se aglomerar em torno da toxina, uma semelhança que Bang observou em seu artigo de 1956 sobre o sangue do caranguejo-ferradura. Ao longo da próxima década e meia, ele e um jovem patologista chamado Jack Levin desenvolveram uma maneira padronizada de extrair LAL. Só em 1977, entretanto, a Food and Drug Administration permitiu que as empresas farmacêuticas substituíssem suas grandes colônias de coelhos por kits de LAL. Agora você simplesmente adicionou LAL ao material testado e virou o frasco para ver se ficou sólido – muito mais rápido e conveniente. O teste de LAL ainda exigia o uso de animais, mas o terrível processo de enfiar agulhas nos animais foi escondido e terceirizado para uma parte diferente da cadeia de suprimentos.
Na época, Ding estava procurando por caranguejos-ferradura em Cingapura , A LAL havia se tornado uma indústria multimilionária. Um quarto de sangue de caranguejo-ferradura vale US $ 15.000. E os kits de LAL de que ela precisava para testar a contaminação de embriões de fertilização in vitro eram muito caros. Um kit, ela lembra, custou US $ 1.000 para ela em Cingapura.
Razão pela qual ela pensou em fazer seu próprio lisado. Mas a espécie de caranguejo-ferradura que ela estava estudando em Cingapura, Carcinoscorpius rotundicauda, é muito menor do que os caranguejos-ferradura do Atlântico, e eles não podiam ser sangrados muito sem morrer. Então, Ding decidiu fazer uma alternativa ao LAL que eventualmente não exigiria caranguejos-ferradura.
O que seria necessário era a manipulação do DNA. Sua ideia era unir o gene do caranguejo-ferradura responsável pela capacidade de caça de toxinas do LAL em células que crescem facilmente em um laboratório, como o fermento. A biotecnologia como campo já estava se movendo na direção do DNA recombinante, que envolve pegar DNA de uma espécie e colocá-lo em outra. Alguns anos antes, em 1982, a Eli Lilly começou a vender insulina humana cultivada em tonéis de bactérias.
Ding teve um bom ponto de partida para sua alternativa LAL. A essa altura, os cientistas já haviam identificado o fator C, a molécula específica da LAL que detecta toxinas bacterianas. Então, ela começou a procurar o gene que cria o fator C. Sua equipe de pesquisa pegou células de caranguejos-ferradura que eles coletaram e as sangrou minimamente. (Eles também tentaram, mas não conseguiram, cultivar caranguejos-ferradura em um laboratório e reproduzi-los por fertilização in vitro.)
A sensibilidade do caranguejo-ferradura a toxinas bacterianas infelizmente também tornava difícil estudar. As toxinas, ao que parece, estão por toda parte – na água, em tubos de ensaio, em placas de Petri. “Você tem que assar todos os utensílios de vidro assados a 200 a 220 graus por várias horas.” diz Ding. Eles também tiveram que comprar água especial que foi tratada para não conter toxinas bacterianas. Se você não tomasse cuidado, seu tubo de solução poderia facilmente se transformar em gel.
Quando Ding e Ho finalmente identificaram o gene para o fator C, eles o uniram em levedura. Isso falhou porque, embora a levedura produzisse o fator C, ela não secretava a molécula. “A levedura era muito difícil de abrir. Era muito impuro e confuso ”, diz ela. Eles tentaram outro tipo de levedura e células de mamíferos – essas também falharam. No final da década de 1990, Ding e Ho participaram de um curso nos Estados Unidos e aprenderam sobre sistemas de vetores de baculovírus. Aqui, um vírus é usado para inserir o fator C nas células intestinais dos insetos, transformando-as em pequenas fábricas para a molécula. Insetos e ferraduras têm uma linhagem evolutiva compartilhada: ambos são artrópodes. E essas células funcionaram maravilhosamente.
Finalmente, uma década e meia depois de começar, Ding tinha uma alternativa para LAL que funcionava sem causar mais danos caranguejos-ferradura. Ela se enfiou na biblioteca para estudar patentes e redigiu o formulário por conta própria. Então ela o enviou e esperou que o mundo mudasse.
O mundo não mudou, pelo menos não para os caranguejos-ferradura. Demorou três anos para que o primeiro kit de teste de fator C recombinante baseado na patente de Ding fosse lançado em 2003, mas mesmo assim as empresas farmacêuticas mostraram pouco interesse.
As empresas tinham uma série de razões. Havia apenas um fornecedor do kit, uma empresa que hoje faz parte da empresa química baseada na Suíça Lonza. As empresas farmacêuticas temiam confiar em uma única fonte para uma parte tão importante de sua fabricação. E se algo acontecer com Lonza?Ou um desastre natural atingiu sua fábrica? As empresas que sangram caranguejos também podem perder muito dinheiro se o fator C for amplamente adotado. Das seis empresas com instalações de sangramento de caranguejos nos Estados Unidos, duas recusaram entrevistas, uma não respondeu a um pedido de entrevista e duas praticamente não têm presença pública. O sexto é a Lonza, que atualmente vende LAL e o fator recombinante.
Lonza, por sua vez, culpou os regulamentos pela lenta aceitação. Nos Estados Unidos, o FDA instrui as empresas que realizam testes de toxinas bacterianas a seguir a Farmacopeia dos Estados Unidos, um manual que estabelece os padrões de medicamentos. Em uma orientação de 2012, o FDA disse que as empresas poderiam usar o fator C recombinante, que não aparece na farmacopeia, se realizassem seus próprios testes de validação. “O risco é, obviamente, o FDA pode não aceitar sua validação e você não pode levar seu produto ao mercado”, disse a porta-voz da Lonza, Katrin Hoeck. “As empresas farmacêuticas são avessas ao risco.” A indústria levou décadas para mudar de coelhos para LAL também.
A realidade dos negócios foi uma verdadeira decepção para Ding. “Estávamos tão entusiasmados como pesquisadores, tão felizes por ele estar funcionando”, diz ela. “E pensamos que o fator C recombinante seria adotado em todo o mundo e o caranguejo-ferradura seria salvo.”
Recentemente, no entanto, algumas coisas mudaram o cálculo recente de risco-recompensa para as empresas farmacêuticas. Por um lado, a Lonza não é mais o único fornecedor. Em 2013, a Hyglos se tornou a segunda empresa a produzir o fator C recombinante. Kevin Williams, um cientista sênior da Hyglos, diz que vê como uma modernização há muito atrasada: as empresas farmacêuticas pararam de depender de porcos e começaram a produzir insulina em leveduras e células bacterianas há décadas. Por que a mesma tecnologia não pode ser aplicada ao mesmo teste usado para verificar se a insulina é segura para injeção?
Do lado regulatório, a Farmacopeia Europeia adicionou fator C recombinante como um teste de toxina bacteriana aceito em 2016, abrindo caminho para mudanças nos Estados Unidos. Várias empresas farmacêuticas, principalmente a Eli Lilly, compararam a eficácia do fator C recombinante e LAL.
Jay Bolden, um especialista em bactérias detecção de toxina na Eli Lilly, lembra Lonza chegando em seus laboratórios com o kit de fator C recombinante há mais de uma década. Ele ficou intrigado na época, mas ainda não estava disposto a mergulhar. O ponto de virada veio em 2013, quando a Eli Lilly começou a planejar uma fábrica de insulina na China, onde a espécie nativa do caranguejo-ferradura está diminuindo. “Você ouviria coisas sobre um dia que o caranguejo-ferradura poderia ficar restrito”, diz Bolden. Em contraste, a cadeia de suprimentos do fator C recombinante parecia mais segura com os fornecedores Hyglos e Lonza. LAL e fator C também são comparáveis em custo.
Bolden diz que Eli Lilly decidiu “traçar uma linha na areia”: todos os novos produtos após um certo ponto seriam testados com fator C recombinante. A empresa recentemente apresentou ao FDA seu primeiro pedido de medicamento— galcanezumabe para prevenir enxaquecas – onde o medicamento final será testado de qualidade com fator C. Ele também examinou o uso de fator C recombinante durante o processo de fabricação para testar água e equipamentos, que atualmente respondem pela grande maioria do uso de LAL. Bolden diz que a Eli Lilly tem feito lobby junto à Farmacopeia dos EUA para incluir o fator C recombinante.
Na quinta-feira, Bolden fará uma palestra em Cape May, Nova Jersey, em um evento organizado pela Revive & Restore, uma organização sem fins lucrativos mais conhecida por seu trabalho em trazer espécies extintas de volta à vida. “Nossa missão é usar a biotecnologia para a conservação”, diz Ryan Phelan, cofundador e diretor executivo da Revive & Restore. Phelan conheceu Ding quando ela viajou para Cingapura para comprar um produto sintético -conferência de biologia em 2017, e ela percebeu que sua pesquisa sobre o fator C recombinante se encaixava perfeitamente na interseção de conservação e biotecnologia.
Revive & Restore e seus parceiros de conservação – New Jersey Audubon, American Littoral Society e Delaware River Keeper Network – escolheram o local de Cape May porque os caranguejos-ferradura vêm aqui toda primavera para desovar. Você não pode mais pegar ferradura caranguejos aqui devido à sua importância para uma espécie de ave migratória ameaçada chamada de nó vermelho. Essas aves também aparecem aqui na primavera. Sua migração é programada para que as aves que voam da América do Sul para o Ártico possam se empanturrar de ovos de caranguejo-ferradura. As praias ficam pretas de caranguejos, Ele estala e clica enquanto as fêmeas lutam para colocar seus ovos e os machos para fertilizá-los.Os nós vermelhos lutam para comer. Eles quase dobram de peso em sua jornada para o Ártico.
É uma sincronia antiga entre as espécies, que começou muito antes de os humanos começarem a colher caranguejos-ferradura para sangue e esperançosamente durará muito depois.