Według legendy miasto Rzym zostało założone w 753 roku pne nad brzegiem Tybru, około 25 kilometrów (16 mil) od morza w Ostii. Wyspa Tyberyjska, w centrum rzeki między Trastevere a starożytnym centrum miasta, była miejscem ważnego starożytnego brodu, który później został przerzucony mostem. Legenda mówi, że założyciele Rzymu, bracia bliźniacy Romulus i Remus, zostali porzuceni na jego wodach, gdzie zostali uratowani przez wilczycę Lupę.
Rzeka wyznaczała granicę między ziemiami Etrusków na zachodzie Sabiny na wschodzie i Łacina na południu. Benito Mussolini, urodzony w Romagnie, dostosował granicę między Toskanią a Emilią-Romagną, tak aby źródła Tybru leżały w Romanii.
Tyber był niezwykle ważny dla rzymskiego handlu i handlu, ponieważ statki mogły dotrzeć do 100 kilometrów (60 mil) w górę rzeki; istnieją dowody na to, że był używany do wysyłania zboża z Val Teverina już w V wieku pne . Później był używany do transportu kamienia, drewna i żywności do Rzymu.
Podczas wojen punickich w III wieku pne port w Ostii stał się kluczową bazą morską. Później stał się najważniejszą bazą w Rzymie. port, do którego importowano pszenicę, oliwę z oliwek i wino z rzymskich kolonii wokół Morza Śródziemnego. Nabrzeża budowano także wzdłuż on riverside w samym Rzymie, wzdłuż brzegów rzeki wokół obszaru Marsa. Rzymianie połączyli rzekę systemem kanalizacyjnym (Cloaca Maxima) oraz podziemną siecią tuneli i innych kanałów, aby woda trafiała do centrum miasta.
Bogaci Rzymianie mieli parki ogrodowe lub „horti” nad brzegiem rzeki w Rzymie do pierwszego wieku pne. Mogły one zostać sprzedane i opracowane około sto lat później.
Silna sedymentacja rzeki utrudniła utrzymanie Ostii, co skłoniło cesarzy Klaudiusza i Trajana do założenia nowego portu na Fiumicino w I wieku OGŁOSZENIE. Zbudowali nową drogę, via Portuensis, łączącą Rzym z Fiumicino, opuszczając miasto przez Porta Portese („brama portowa”). Oba porty zostały ostatecznie opuszczone z powodu zamulenia.
Kilku papieży próbowało poprawić żeglugę na Tybrze w XVII i XVIII wieku, a intensywne prace pogłębiania kontynuowano w XIX wieku. Handel był ożywiony przez jakiś czas, ale w XX wieku zamulanie spowodowało, że rzeka była żeglowna tylko do samego Rzymu.
Tyber był kiedyś znany z powodzi – Kampus Marsa jest równiną zalewową i regularnie wylewałby się na głębokość 2 metrów (6 stóp 7 cali). Rzeka jest teraz ograniczona przez wysokie kamienne wały, które rozpoczęto w 1876 roku. W obrębie miasta brzegi rzeki są otoczone bulwarami zwanymi lungoteveri, ulicami „wzdłuż Tybru”.
Ponieważ rzeka jest utożsamiana z Rzymem , terminy „pływanie Tybru” lub „przekraczanie Tybru” stały się protestanckim skrótem określającym przejście na katolicyzm. Dzieje się tak najczęściej, jeśli osoba, która nawraca się, była anglikaninem, którego odwrotność określa się jako „pływanie w Tamizie” lub „przekraczanie Tamizy”.
W starożytnym Rzymie stracono zbrodniarzy. Tyber. W dalszej części panowania cesarza Tyberiusza, do Tyberu wrzucono ludzi straconych na schodach Gemonii. Ta praktyka trwała przez wieki. Na przykład zwłoki papieża Formozusa wrzucono do Tybru po niesławnym synodzie zwłok, który odbył się w 897 roku.