Kraby podkowiaste są czasami nazywane „żywymi skamielinami”, ponieważ występują w jakiejś formie od ponad 450 milionów lat. W tym czasie Ziemia przeszedł przez wiele głównych epok lodowcowych, Wielkie Śmierć, powstanie i późniejszy rozpad Pangaei oraz uderzenie asteroidy, które po raz kolejny zabiło dinozaury i większość życia na Ziemi. Innymi słowy, kraby podkowiaste naprawdę coś widziały.
Jednak przypuszczam, że niektóre z ich najdziwniejszych doświadczeń musiały nastąpić w ciągu ostatnich kilku dekad, jako jeden z ssaków o miękkich ciałach, pojawiło się po tym, jak dinozaury zaczęły masowo wyłapywać kraby podkowiaste z oceanu. Współcześni ludzie nie zabijają krabów podkowiastych celowo – tak jak robili to w poprzednich stuleciach rolnicy łowiący je na nawóz lub rybacy używający ich jako przynęty. Zamiast tego szorują kraby oczyszczają z pąkli, składają pancerze na zawiasach i trzymają stal nierdzewną el igły w miękkie, słabe miejsce, aby pobrać krew. Krew kraba podkowiastego jest niebieska i mętna, jak płyn niezamarzający zmieszany z mlekiem.
A do czego właściwie ludzie potrzebują krwi żywej skamieliny? Można powiedzieć, że jest to rodzaj czarów, które dosłownie utrzymują ludzi przy życiu. Krew kraba podkowiastego jest wyjątkowo wrażliwa na toksyny bakterii. Służy do testowania pod kątem zanieczyszczenia podczas produkcji wszystkiego, co może dostać się do ludzkiego ciała: każdego zastrzyku, każdego kroplówki i każdego wszczepionego urządzenia medycznego.
Współczesny przemysł biomedyczny jest tak uzależniony od tej krwi, że zniknięcie krabów podkowiastych natychmiast go sparaliżował. W ostatnich latach kraby podkowiaste, szczególnie w Azji, są narażone na szereg zagrożeń: utratę siedlisk, ponieważ fale morskie zastępują plaże, na których się rozmnażają, zanieczyszczenie, przełowienie w celu wykorzystania ich jako pożywienie i przynęta. Kraby podkowiaste wykrwawione do celów biomedycznych w Stanach Zjednoczonych wracają do oceanu, ale szacuje się, że każdego roku w tym procesie umiera również około 50 000.
Jest jednak inny sposób – sposób na to, aby współczesna medycyna wykorzystują raczej nowoczesną technologię niż krew starożytnych zwierząt. Syntetyczny substytut krwi kraba podkowiastego jest dostępny od 15 lat. To opowieść o tym, jak naukowcom po cichu udało się prześcignąć miliony lat ewolucji i dlaczego tak długo zajęło reszcie świata nadrobienie zaległości.
Więcej historii
Jeak Ling Ding mówi, że „zawsze była szczurem laboratoryjnym” – biologiem, który nosił białe fartuchy, a nie takim, który brodził w błocie. Jednak w połowie lat osiemdziesiątych zaczęła chodzić w błocie w poszukiwaniu krabów podkowiastych. Estuarium, w którym mieszkali, wspomina z dyskretnym tonem, „wcale nie pachniało zbyt słodko”.
Ding, wraz z mężem i badaczami partner Bow Ho, przybył do kraby podkowiastego okrężnie, a ich ostatecznym celem było wyeliminowanie tych zwierząt w badaniach biomedycznych. W tamtym czasie była biologiem molekularnym na Uniwersytecie Narodowym w Singapurze, a szpitalny oddział zapłodnienia pozaustrojowego przybył do Ding i Ho z problemem: ich zarodki nie przeżyłyby wystarczająco długo – czy może to być spowodowane zakażeniem bakteryjnym? ?
Standardowym testem w tamtym czasie – i obecnie – jest LAL, co oznacza lizat limulus amebocyte. Limulus odnosi się do Limulus polyphemus, gatunku kraba podkowiastego pochodzącego z wybrzeża Atlantyku w Ameryce Północnej. Amebocyte to komórki krwi kraba. A lizat to materiał uwolniony z komórek po ich „zlizowaniu” lub rozbiciu. Jest to materiał niezwykle wrażliwy na toksyny bakteryjne.
Pierwszą osobą, która dowiedziała się o LAL był Frederik Bang. Trzydzieści lata przed Ding – i 9000 mil dalej na Cape Cod – on również zbierał kraby podkowiaste na brzegu (z nie do końca zrozumiałych powodów kraby podkowiaste występują tylko na wschodnich wybrzeżach Ameryki Północnej i Azji). Bang, patolog, był zainteresowany prymitywnym układem odpornościowym stworzenia. Zdecydował się na protokół wstrzykiwania bakterii z wody morskiej bezpośrednio do krabów podkowiastych, co powoduje zlepianie się ich krwi w „żylaste masy”.
Bang podejrzewał, że krzepnięcie miało jakiś cel. Unieruchomił bakterie, odcinając resztę ciała kraba podkowiastego przed atakującym patogenem. Co ciekawe, ich krew zamieniała się w żel, nawet jeśli najpierw gotował zastrzyk bakterii przez pięć lub 10 minut. Powinno to zabić bakterie i wysterylizować wstrzyknięty roztwór. Bang zdał sobie sprawę, że krew jest wrażliwa nie tylko na żywe bakterie, ale także na toksyny bakteryjne, które utrzymują się nawet po sterylizacji.
Ludzki układ odpornościowy może być znacznie bardziej wyrafinowany niż u kraba podkowiastego, ale też reaguje na te toksyny. Lekarze po raz pierwszy zdali sobie z tego sprawę pod koniec XIX wieku, kiedy pacjenci, którym podano sterylne zastrzyki, mimo wszystko cierpieli na „gorączkę zastrzykową” lub „gorączkę solną”. W najgorszych przypadkach toksyny mogą spowodować wstrząs septyczny, a nawet śmierć.
W czasach, gdy Bang prowadził te badania w latach pięćdziesiątych XX wieku, standardowym sposobem badania toksyn bakteryjnych było wstrzyknięcie próbki królikom. Wymagało to, aby ktoś co 30 minut przez trzy godziny sprawdzał temperaturę królików pod kątem oznak gorączki, która sugerowałaby zakażenie bakteryjne.
Pod pod mikroskopem, komórki krwi królika również miały tendencję do zlepiania się wokół toksyny, co Bang zauważył w swoim artykule z 1956 roku o krwi kraba podkowiastego. Przez następne półtorej dekady on i młody patolog o imieniu Jack Levin opracowali ustandaryzowany sposób ekstrakcji LAL. Jednak dopiero w 1977 r. Agencja ds. Żywności i Leków zezwoliła firmom farmaceutycznym na zastąpienie dużych kolonii królików zestawami LAL. Teraz po prostu dodałeś LAL do badanego materiału i odwróciłeś fiolkę, aby zobaczyć, czy stała się stała – znacznie szybciej i wygodniej. Test LAL nadal wymagał użycia zwierząt, ale makabryczny proces wbijania igieł w zwierzęta został ukryty i przeniesiony do innej części łańcucha dostaw.
Do czasu, gdy Ding szukał krabów podkowiastych w Singapurze , LAL stał się przemysłem wartym wiele milionów dolarów. Jedna litra krwi kraba podkowiastego jest podobno warta nawet 15 000 dolarów. A zestawy LAL, których potrzebowała do badania skażenia zarodków in vitro, były o wiele za drogie. Przypomina sobie, że jeden zestaw kosztował za nią 1000 dolarów w Singapurze.
Dlatego rozważała stworzenie własnego lizatu. Ale gatunek krabów podkowiastych, które badała w Singapurze, Carcinoscorpius rotundicauda, jest znacznie mniejszy niż krabów podkowiastych atlantyckich i nie można ich było dużo wykrwawić bez śmierci. Dlatego Ding postanowił stworzyć alternatywę dla LAL, która ostatecznie w ogóle nie wymagałaby krabów podkowiastych.
Wymagałoby to manipulacji DNA. Jej pomysłem było połączenie genu kraba podkowiastego odpowiedzialnego za zdolność LAL do polowania na toksyny w komórki, które łatwo rosną w laboratorium, takie jak drożdże. Biotechnologia jako dziedzina podążała już w kierunku rekombinowanego DNA, co pociąga za sobą branie DNA z jednego gatunku i umieszczanie go w innym. Kilka lat wcześniej, w 1982 roku, Eli Lilly zaczęła sprzedawać ludzką insulinę hodowaną w kadziach z bakteriami.
Ding miała dobry punkt wyjścia dla swojej alternatywy LAL. Do tego czasu naukowcy zidentyfikowali czynnik C, specyficzną cząsteczkę w LAL, która wykrywa toksyny bakteryjne. Zaczęła więc poszukiwać genu odpowiedzialnego za czynnik C. Jej zespół badawczy pobrał komórki z krabów podkowiastych, które zebrał, i wykrwawił je w minimalnym stopniu. (Próbowali również, ale nie udało im się, wyhodować kraby podkowiaste w laboratorium i rozmnażać je poprzez zapłodnienie in vitro).
Wrażliwość kraba podkowiastego na toksyny bakteryjne niestety również utrudniała naukę. Okazuje się, że toksyny są wszędzie – w wodzie, w probówkach, na szalkach Petriego. „Musisz piec wszystkie szklane naczynia do pieczenia w temperaturze od 200 do 220 stopni przez kilka godzin”. – mówi Ding. Musieli też kupić specjalną wodę, która została oczyszczona z toksyn bakteryjnych. Gdybyś nie był ostrożny, Twoja tubka z roztworem mogłaby łatwo zamienić się w żel.
Kiedy Ding i Ho w końcu zidentyfikowali gen czynnika C, włożyli go do drożdży. To się nie udało, ponieważ chociaż drożdże wytworzyły czynnik C, nie wydzielały cząsteczki. „Drożdże były bardzo trudne do rozerwania. To było bardzo nieczyste i niechlujne ”- mówi. Wypróbowali inny rodzaj komórek drożdży i ssaków – te też się nie powiodły. Pod koniec lat 90. Ding i Ho uczęszczali na kurs w Stanach Zjednoczonych i dowiedzieli się o systemach wektorów bakulowirusów. Tutaj wirus jest używany do wprowadzenia czynnika C do komórek jelitowych owadów, zamieniając je w małe fabryki dla cząsteczki. Owady i podkowy mają wspólną linię ewolucyjną: oba są stawonogami. I te komórki działały wspaniale.
Wreszcie, półtorej dekady po rozpoczęciu, Ding miała alternatywę dla LAL, która działała bez szkody kraby podkowiaste. Weszła do biblioteki, żeby studiować patenty i sama napisała wniosek. Potem wysłała go i czekała, aż świat się zmieni.
Świat się nie zmienił, przynajmniej nie dla krabów podkowiastych. Pierwszy zestaw testowy na rekombinowany czynnik C oparty na patencie Dinga pojawił się w 2003 roku po trzech latach, ale nawet wtedy firmy farmaceutyczne wykazywały niewielkie zainteresowanie.
Firmy miały kilka powodów. Był tylko jeden dostawca zestawu, firma, która dziś jest częścią szwajcarskiej firmy chemicznej Lonza. Firmy farmaceutyczne obawiały się polegać na jednym źródle w tak istotnej części swojej produkcji. A jeśli coś się stało Lonzie?A może klęska żywiołowa uderzyła w zakład produkcyjny? Firmy, które krwawią kraby, również mogą stracić dużo pieniędzy, jeśli czynnik C zostanie powszechnie przyjęty. Spośród sześciu firm posiadających zakłady krwawiące kraby w Stanach Zjednoczonych, dwie odmówiły wywiadów, jedna nie odpowiedziała na prośbę o wywiad, a dwie praktycznie nie są obecne publicznie. Szóstym jest Lonza, która obecnie sprzedaje zarówno LAL, jak i czynnik rekombinowany.
Lonza ze swojej strony obwinił regulacje za powolne wdrażanie. W Stanach Zjednoczonych FDA nakazuje firmom przeprowadzającym testy na toksyny bakteryjne postępować zgodnie z Farmakopeą Stanów Zjednoczonych, podręcznikiem określającym standardy leków. W wytycznych z 2012 r. FDA stwierdziła, że firmy mogłyby stosować rekombinowany czynnik C, który nie pojawia się w Farmakopei, gdyby przeprowadziły własne testy walidacyjne. „Ryzyko polega oczywiście na tym, że FDA może nie zaakceptować Twojej walidacji i nie możesz wprowadzić produktu na rynek” – mówi rzecznik Lonzy, Katrin Hoeck. „Firmy farmaceutyczne są niechętne ryzyku”. Przeniesienie się z królików na LAL również zajęło branży dekady.
Realia biznesowe były dla Ding prawdziwym rozczarowaniem. „Byliśmy tak zapaleni jako badacze, tak szczęśliwi, że to działa” – mówi. „Myśleliśmy, że rekombinowany czynnik C zostanie przyjęty na całym świecie, a krab podkowy zostanie ocalony”.
Ostatnio jednak kilka rzeczy zmieniło niedawny rachunek ryzyka i zysku dla firm farmaceutycznych. Po pierwsze, Lonza nie jest już jedynym dostawcą. W 2013 roku Hyglos stała się drugą firmą, która wyprodukowała rekombinowany czynnik C.Kevin Williams, starszy naukowiec w Hyglos, mówi, że widzi długo oczekiwaną modernizację: firmy farmaceutyczne przestały polegać na świniach i zaczęły wytwarzać insulinę w drożdżach i komórkach bakteryjnych dziesiątki lat temu. Dlaczego nie można zastosować tej samej technologii do samego testu używanego do sprawdzenia, czy insulina jest bezpieczna do wstrzyknięcia?
Ze względów regulacyjnych Farmakopea Europejska dodała rekombinowany czynnik C jako akceptowany test toksyn bakteryjnych w 2016, torując drogę do zmian w Stanach Zjednoczonych. Wiele firm farmaceutycznych, w szczególności Eli Lilly, porównało skuteczność rekombinowanego czynnika C i LAL.
Jay Bolden, ekspert w dziedzinie bakterii wykrywanie toksyn w Eli Lilly, przypomina, że Lonza przyszedł do ich laboratoriów z zestawem rekombinowanego czynnika C ponad dziesięć lat temu. Był wtedy zaintrygowany, ale nie był jeszcze skłonny do podjęcia takiej decyzji. Punkt zwrotny nastąpił w 2013 roku, kiedy Eli Lilly zaczęła planować fabrykę insuliny w Chinach, gdzie spada liczebność rodzimych gatunków krabów podkowiastych. „Można usłyszeć rzeczy o tym, że pewnego dnia krab podkowy może zostać ograniczony” – mówi Bolden. W przeciwieństwie do tego, łańcuch dostaw rekombinowanego czynnika C wyglądał na bezpieczniejszy w przypadku Hyglos i Lonza jako dostawców. LAL i czynnik C są również porównywalne pod względem kosztów.
Bolden mówi, że Eli Lilly zdecydowała się „narysować linię na piasku”: Wszystkie nowe produkty po pewnym czasie będą testowane z rekombinowanym czynnikiem C. Firma niedawno złożyła do FDA swój pierwszy wniosek o lek— galcanezumab w zapobieganiu migrenom – gdzie ostateczny lek będzie testowany pod kątem jakości z czynnikiem C. Badano również użycie rekombinowanego czynnika C podczas procesu produkcyjnego do testowania wody i sprzętu, który obecnie stanowi zdecydowaną większość zastosowań LAL. Bolden mówi, że Eli Lilly lobbował w amerykańskiej Farmakopei, aby włączyła rekombinowany czynnik C.
W czwartek Bolden przemówi w Cape May w stanie New Jersey podczas wydarzenia zorganizowanego przez Revive & Restore, organizacja non-profit najbardziej znana z pracy nad przywracaniem do życia wymarłych gatunków. „Naszą misją jest wykorzystanie biotechnologii do konserwacji” – mówi Ryan Phelan, współzałożyciel i dyrektor wykonawczy Revive & Restore. Phelan po raz pierwszy spotkała Dinga, kiedy podróżowała do Singapuru, – konferencji biologii w 2017 roku i zdała sobie sprawę, że jej badania nad rekombinowanym czynnikiem C znalazły się idealnie na przecięciu ochrony przyrody i biotechnologii.
Revive & Restore i jego partnerzy w zakresie ochrony – New Jersey Audubon, American Littoral Society i Delaware River Keeper Network – wybrali lokalizację Cape May, ponieważ kraby podkowiaste przybywają tu każdej wiosny, aby się rozmnażać. Nie można już łapać podkowy kraby ze względu na ich znaczenie dla zagrożonych gatunków ptaków wędrownych zwanych czerwonymi węzłami. Ptaki te pojawiają się tu również wiosną. Ich migracja jest tak zaplanowana, aby ptaki lecące z Ameryki Południowej do Arktyki mogły zajadać się kawiorowym Jaja krabów podkowiastych Plaże czernieją od krabów, ich ona Klika klekocząc, gdy samice usiłują złożyć jaja, a samce, by je zapłodnić.Czerwone sęki biegną do jedzenia. Ich waga prawie się podwoiła podczas podróży do Arktyki.
Jest to starożytna synchronizacja między gatunkami, która rozpoczęła się na długo przed tym, jak ludzie zaczęli zbierać kraby podkowiaste na krew i miejmy nadzieję, że potrwa długo później.