Ant-infecterende Ophiocordyceps-genomen onthullen een grote diversiteit aan potentiële gedragsmanipulatiegenen en een mogelijke belangrijke rol voor enterotoxinen

Genoomkenmerken

De Ophiocordyceps-conceptgenomen die in deze studie zijn gegenereerd (Tabel 1) werden samengesteld met uitlezingen gegenereerd over verschillende sequencing-runs met behulp van twee soorten DNA-bibliotheken. Alleen de runs die leidden tot hoogwaardige reads werden gebruikt voor assemblage (zie Materialen en methoden). Contig-assemblage resulteerde in genoomgroottes variërend van 21,91–23,92 miljoen basenparen (Mbp) voor O. unilateralis s.l. en O. australis s.l. soorten. O. subramanianii s.l. had een geschatte genoomgrootte van 32,31 Mb. Genvoorspelling leverde tussen de 7.621 en 8.629 genen op voor de soorten O. unilateralis en O. australis. Ophiocordyceps subramanianii s.l. werd voorspeld 11.275 genen te hebben. Bovendien GC-inhoud in O. subramanianii s.l. (dwz 60,35%) was veel hoger in vergelijking met de andere Ophiocordyceps-soorten in dit onderzoek (54,66% + / – 1,57%) (tabel 1).

We hebben ook de assemblage en genvoorspelling van het eerder gepubliceerde genoom van O. unilateralis sl stam SC16a (aanvullende tabel S1), die nu de soortnaam O. kimflemingiae 20 heeft gekregen. Behalve dat het minder gefragmenteerd is, is de nieuwe samenstelling kleiner dan eerder gerapporteerd18. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan een betere verzameling repetitieve regios, die het hoogst werden gevonden in de unilateralis-soort (6,59-6,83%) in vergelijking met de andere-mieren-infecterende soorten in deze studie (tabel 1). Ondanks de kleinere assemblagegrootte, verhoogde de nieuwe genvoorspelling het aantal genen met 798 genen. Deze toename wordt voornamelijk veroorzaakt door de voorspelling van minder chimeren (dwz naburige genen die onjuist zijn samengevoegd in één genmodel) met behulp van de Braker1-pijplijn (gegevens niet getoond).

Voor alle genomen op één na gegenereerd in in deze studie werd de genvoorspelling geïnformeerd door RNA-Seq reads. Voor de eerder gerapporteerde Noord-Amerikaanse unilateralis-soort O. kimflemingiae werden reads gebruikt die in die eerdere studie waren gegenereerd18. Door problemen met het cultiveren van de Braziliaanse O. camponoti-rufipedis, werd niet genoeg materiaal verkregen om RNA-Seq-gegevens te genereren naast de DNA-aflezingen die nodig zijn om een ontwerpgenoom te verkrijgen. Omdat zowel O. kimflemingiae als O. camponoti-rufipedis binnen hetzelfde soortcomplex (unilateralis) leven, hebben we geprobeerd de Noord-Amerikaanse unilateralis-soorten in kaart te brengen in het O. camponoti-rufipedis-genoom om te zien of ze konden worden gebruikt om annotaties te informeren. Hoewel 93% van de O. kimflemingiae-reads in kaart is gebracht op zijn eigen genoom, is slechts 43% toegewezen aan het O. camponoti-rufipedis-genoom (aanvullende tabel S2). We hebben bovendien de reads toegewezen aan een andere gepubliceerde O. unilateralis s.l. genoom, dat van O. polyrhachis-furcata 22, om te bepalen of dit een meer algemeen cross-mapping effect zou zijn of specifiek voor het O. camponoti-rufipedis-genoom. Een vergelijkbare mapping van 41% resulteerde. Dit suggereert dat unilateralis-soorten over het algemeen nogal ver verwant kunnen zijn, waardoor cross-mapping om annotatie te informeren minder geschikt is. Voor informatieve doeleinden hebben we ook de australis-soorten met elkaar in kaart gebracht (stammen MAP-64 uit Brazilië en 1348a uit Ghana). Dit resulteerde in 71% en 82% cross-mapped reads versus 86% en 97% toegewezen aan respectievelijk hun eigen genomen (aanvullende tabel S2). Dit impliceert dat soorten in het australis-complex dus waarschijnlijk veel nauwer verwant zijn aan elkaar dan soorten in het unilateralis-complex.

Orthologe clusters

We wilden onderzoeken welke genvoorspellingen van de miereninfecterende Ophiocordyceps-soorten in deze studie zijn waarschijnlijk geconserveerd en worden gedeeld met andere ascomyceten. Daarnaast wilden we ontdekken welke soortspecifieke en manipulatiespecifieke specialisaties mogelijk hebben plaatsgevonden. Als zodanig werden de voorspelde proteomen van onze vijf mieren-infecterende schimmels vergeleken met die van 18 andere ascomyceten. Van deze soorten werden er tien vergeleken. waren dierlijke parasieten (twee infecterende zoogdieren, twee infecterende nematoden en zes infecterende insecten) en 13 leven binnen dezelfde orde (Hypocreales). Vier soorten behoorden tot dezelfde familie (Ophiocordycipitaceae) en twee behoorden tot hetzelfde geslacht (Ophiocordyceps). A fylogenetische reconstructie op basis van 67 geconserveerde genen die in elk van deze organismen aanwezig zijn, wordt weergegeven in figuur 2.

In totaal 51.012 orthologe clusters inclusief alle geannoteerde eiwitten van elk van de 23 ascomyceten die in deze analyse zijn opgenomen (aanvullende gegevens S1). Samenvattende statistieken met betrekking tot deze clustering zijn te vinden in aanvullende figuur S1. We vergeleken de overlapping van orthologe clusters tussen drie soortenbereiken: 1) de miereninfecterende schimmels, die alle vijf ontwerpgenomen omvatten die in deze studie werden gegenereerd, 2) de andere insecten-infecterende schimmels Ophiocordyceps sinensis, Tolypocladium inflatum, zowel Metarhizium als beide Cordyceps-soorten , en 3) alle niet-insecten-infecterende ascomyceten, waaronder andere dier-infecterende, plant-infecterende, schimmel-infecterende en saprofytische schimmels. De resultaten van deze analyse worden weergegeven in het Venn-diagram van Fig. 3a. Vervolgens hebben we verrijkingsanalyses uitgevoerd voor de functionele annotaties van genen van soorten die mieren infecteren die werden aangetroffen in de verschillende overlappende en niet-overlappende delen van het diagram. Van de 7.931 orthologe clusters die werden gevonden binnen alle drie soortenreeksen, waren Gene Ontology (GO) annotaties voor algemene biologische processen significant oververtegenwoordigd. Dit suggereert, zoals je zou verwachten, dat ascomyceten met verschillende levensstijlen vergelijkbare mechanismen gebruiken voor algemene processen zoals transcriptie, translatie, eiwittransport en signaaltransductie. Genen waarvan werd voorspeld dat ze coderen voor (kleine) uitgescheiden eiwitten, eiwitten met GO-annotaties voor multi-organisme processen en pathogenese, en meer specifiek uitgescheiden vermoedelijke enterotoxinen, waren echter ondervertegenwoordigd. Toen we een verrijkingsanalyse uitvoerden van annotaties die aanwezig zijn in orthologe clusters die alleen werden aangetroffen in de miereninfecterende soorten (d.w.z. 6,672 clusters, figuur 3a), vonden we het tegenovergestelde resultaat. GO-annotaties voor (grotendeels dezelfde) algemene biologische processen waren significant ondervertegenwoordigd, terwijl (kleine) uitgescheiden eiwitten, eiwitten met GO-annotaties voor multi-organisme processen en pathogenese, en vermeende enterotoxines oververtegenwoordigd waren. Dit suggereert dat een aanzienlijk deel van het secretoom van de mieren-infecterende schimmels in deze studie specifiek voor hen is. Deze specificiteit bleek deels te wijten aan enterotoxinen die deel uitmaken van het secretoom en bioactieve kleine afgescheiden eiwitten (SSPs) die belangrijk kunnen zijn bij schimmel-mierinteracties. (Kleine) uitgescheiden eiwitten waren ook oververtegenwoordigd onder de clusters die ant-infecterende schimmels exclusief deelden met andere entomopathogenen (262 clusters) of niet-entomopathogenen (449 clusters). Dit geeft aan dat hun secretomen ook meer algemene entomopathogeen-specifieke eiwitten bevatten, evenals eiwitten die uitsluitend worden gedeeld met niet-entomopathogene ascomyceten.

We onderzochten ook hoe orthologe clusters, die alleen werden aangetroffen onder de miereninfecterende schimmels, door die soorten werden weergegeven (Fig. 3b). Van de in totaal 6.672 clusters in deze vergelijking bleek 90,6% soortspecifiek te zijn. Clusteroverlap was dus marginaal, hoewel alle soorten in deze studie binnen hetzelfde geslacht (Ophiocordyceps) en in sommige gevallen zelfs binnen hetzelfde soortencomplex (O. unilateralis s.l. en O. australis s.l.) voorkomen. Het analyseren van verrijking van functionele annotatietermen in deze soortspecifieke clusters resulteerde opnieuw in oververtegenwoordigingen van (kleine) uitgescheiden eiwitten. Hoewel marginaal, werd de meeste clusteroverlap gevonden tussen nauwer verwante soorten binnen hetzelfde complex (d.w.z. O. australis s.l., 289 clusters en O. unilateralis s.l., 182 clusters Fig. 3b). Ook hier lieten verrijkingsanalyses een oververtegenwoordiging zien voor (kleine) uitgescheiden eiwitten. Het lijkt er dus op dat een statistisch significante hoeveelheid van het schimmelsecretoom van deze miereninfecterende soorten ofwel complex- ofwel soortspecifiek is. Bovendien vonden we een oververtegenwoordiging van pathogeniteits-GO-termen in de complexspecifieke orthologe clusters. Deze bevinding kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van orthologe enterotoxinen bij soorten binnen hetzelfde complex.Slechts vier clusters die niet aanwezig waren in een van de andere ascomyceten in onze vergelijking, werden gedeeld door alle vijf mieren-infecterende soorten (Fig. 3b). Geen van deze vier clusters ontving een functionele annotatie, maar drie van hen bevatten genen met voorspelde secretiesignalen. Voor drie van de vier clusters resulteerde een BLASTp-analyse van de genen tegen de NCBI-database uitsluitend in hypothetische eiwithits met de eerder gedeponeerde versie van het O. kimflemingiae-genoom. Dit geeft aan dat deze clusters inderdaad eiwitten kunnen vertegenwoordigen die uniek zijn voor miereninfecterende Ophiocordyceps-soorten. Eiwitsequenties binnen het vierde cluster resulteerden in hits met metalloproteasen naast het opnieuw uitlijnen met een hypothetisch eiwit van O. kimflemingiae (XA68_3159), (aanvullende tabel S3). Dit cluster kan dus vermeende metalloproteasen bevatten die uitsluitend worden aangetroffen in de genomen van de hier onderzochte schimmelsoort die mieren infecteert. Bovendien werden slechts 2 van de clusters die uniek werden gevonden in de mieren-infecterende schimmels gedeeld door alle vier soorten die bijtgedrag induceren (Fig. 3b). Een BLASTp-analyse van de genen binnen deze clusters resulteerde opnieuw in hypothetische eiwithits met de eerder gedeponeerde versie van het O. kimflemingiae-genoom18 (aanvullende tabel S4).

Kandidaat-manipulatiegenen die betrokken zijn bij het vaststellen van bijtgedrag

We analyseerden de conservering van kandidaatgenen die geassocieerd zijn met de gemanipuleerde bijtgebeurtenis die werd waargenomen bij geïnfecteerde mieren. We gebruikten eerder gepubliceerde transcriptomics-gegevens18 en herbepaalden de differentiële genexpressie door de gegevens in kaart te brengen in de nieuwe versie van het O. kimflemingiae-genoom. Volgens de eerder gepubliceerde studie volgden we de redenering dat kandidaat-genen, die betrokken zijn bij het vaststellen van gemanipuleerd bijtgedrag, tijdens dit evenement opwaarts gereguleerd zouden worden en daarna snel weer naar beneden. Als zodanig werden 547 kandidaat-genen geïdentificeerd, dat zijn er 49 meer dan gerapporteerd in de vorige analyse18. In lijn met de eerder gerapporteerde gegevens waren genen die betrokken zijn bij DNA-replicatie, oxidatie-reductieprocessen, secretie en secundair metabolisme oververtegenwoordigd.

De conservering van kandidaat-manipulatiegenen werd ook geanalyseerd door middel van orthologe clustering. We vergeleken de overlapping van orthologe clusters die die kandidaatgenen bevatten, die significant omhoog en omlaag gereguleerd waren na gemanipuleerd bijtgedrag in O. kimflemingiae, met drie soortenreeksen: 1) de andere mieren-infecterende schimmels, die de vier nieuwe genomen die in deze studie zijn gegenereerd, 2) de andere insecten-infecterende schimmels, en 3) alle niet-insecten-infecterende ascomyceten die eerder voor vergelijking werden gebruikt. De resultaten van deze analyse worden weergegeven in het Venn-diagram van Fig. 4. Van de kandidaat-manipulatiegenen bleek 78% orthologen te zijn van genen die aanwezig zijn in alle andere drie soortenreeksen (d.w.z. 423 clusters, Fig. 4). Dit impliceert dat de genen die tot expressie worden gebracht tijdens gemanipuleerd bijten geïnduceerd door O. kimflemingiae waarschijnlijk niet specifiek zijn voor manipulatie. Onder deze algemeen gedeelde genen waren CYPs en andere oxidatiereductie-gerelateerde functies oververtegenwoordigd, evenals genen die coderen voor uitgescheiden eiwitten en proteasen. Diverse annotaties van het secundaire metabolisme (clusters 7, 8 en 9) waren ook oververtegenwoordigd in deze breder gedeelde orthologe clusters. Ze omvatten een tryptofaan-dimethylallyltransferase dat betrokken is bij de synthese van moederkorenalkaloïden, verschillende cytochromen, kleine uitgescheiden eiwitten, een polyketidesynthase (PKS) en een PKS-NRPS-hybride (niet-ribosomale eiwitsynthetase). Van de kandidaat-manipulatiegenen die uniek bleken te zijn voor O. kimflemingiae (d.w.z. 59 clusters, Fig. 4), waren alleen SSPs oververtegenwoordigd. 92% van deze unieke genen kreeg echter geen functionele annotatie. Waar enige andere overlap met de drie soortenreeksen werd gevonden, waren SSPs ook oververtegenwoordigd, evenals grotere uitgescheiden eiwitten. Van degenen die alleen aanwezig zijn bij miereninfectie schimmels (dwz 24 clusters Fig. 4), opnieuw ontving de meerderheid (79%) geen functionele annotatie. Van de zeven orthologe clusters die aanwezig waren in alle insecteninfecterende soorten, maar niet in andere ascomyceten, vonden we uitgescheiden enterotoxine. Dit enterotoxine was aanwezig in de bijtgedrag-inducerende soorten O. kimflemingiae (twee orthologen), O. camponoti-rufipedis (1 ortholoog), O. subramanianii sl (twee orthologen) en O. australis-Ghana (twee orthologen) , evenals in O. australis-Brazil en O. sinensis. Bovendien vertoonde een van de twee enterotoxine-orthologen in O. kimflemingiae een dramatisch expressiepatroon met een > 3000 maal hoger -regulatie tijdens manipulatie en een 200-voudige neerwaartse regeling na 18. Dit enterotoxine zou dus mogelijk een belangrijke hoofdrolspeler kunnen zijn bij het tot stand brengen van gedragsmanipulatie door deze Ophiocordyceps-soorten.

Behoud van secundaire metabolietclusters

Een algemene hypothese is dat veranderd gastheergedrag wordt vastgesteld door de afscheiding van secundaire metabolieten naast grotere bioactieve stoffen . Deze hypothese wordt ondersteund door de oververtegenwoordiging van bepaalde geannoteerde secundaire metabolietclusters onder genen van O. kimflemingiae die up-gereguleerd zijn tijdens gemanipuleerd bijtgedrag. Als we deze nauwkeuriger onderzochten, ontdekten we dat inderdaad de genen, binnen maar ook direct naast de geannoteerde secundaire metabolietclusters, dit specifieke expressiepatroon volgden (Fig. 5a). We vroegen of deze clusters bewaard waren gebleven tussen insecten-infecterende Ophiocordyceps-schimmels. Dit zou een gelijkenis suggereren in het gebruik van secundaire metabolieten door deze schimmels om te interageren met hun miergastheren om het waargenomen gemanipuleerde gedrag vast te stellen. Als zodanig hebben we geannoteerde clusters 7,8 en 9 van O. kimflemingiae en hun direct flankerende genen onderzocht. Deze clusters 1) werden opwaarts gereguleerd tijdens gemanipuleerd bijtgedrag, gevolgd door een significante neerwaartse regulatie, en 2) gedeelde orthologen met andere ascomyceten (zie hierboven). Voor de genen binnen deze clusters zochten we naar homologen (BLASTp-uitlijning) en orthologen (orthologe clustering) in de andere vier ant-infecterende schimmels (figuur 5b en aanvullende figuur S3). Dit toonde aan dat de unilateralis-soort ten minste enkele van hun secundaire metabolisme-gerelateerde genen organiseerde in grotendeels vergelijkbare clusters. De andere Ophiocordyceps-soorten hadden homologen en orthologen van deze secundaire metabolismegenen verspreid over hun genomen of bevatten helemaal geen kopie (figuur 5b en aanvullende figuur S3). Zo bevatte geannoteerde cluster 8 in O. kimflemingiae een tryptofaan-dimethylallyltransferase geflankeerd door oxidatiereductiegerelateerde CYPs en een gen met een FAD-bindend domein. Dit cluster wordt direct geflankeerd door zeven genen die een vergelijkbaar expressiepatroon volgden (Fig. 5a). Het O. camponoti-rufipedis-genoom had dit tryptofaan-dimethylallyltransferase op een vergelijkbare manier; geflankeerd door CYPs en een FAD-bindend gen, gevolgd door homologen en orthologen van de naburige genen (Fig. 5b). De O. subramanianii s.l. genoom had ook een vergelijkbaar tryptofaan-dimethylallyltransferase. Het werd echter geflankeerd door niet-homologe / orthologe CYP- en FAD-bindende genen. In feite is O. subramanianii s.l. hadden wel homologen / orthologen van deze genen, maar ze woonden op totaal verschillende contigs, evenals de genen net buiten het geannoteerde secundaire metabolietcluster (Fig. 5b). Bovendien hadden beide australis-soorten geen ortholoog / homoloog gen dat codeert voor dit specifieke tryptofaan-dimethylallyltransferase. In feite bleek de australis-soort uit Ghana helemaal geen tryptofaan-dimethylallyltransferase te bevatten. Soortgelijke conclusies kunnen worden getrokken door de andere secundaire metabolietclusters te analyseren (aanvullende figuur S3). Clusters 7 en 9 van O. kimflemingiae leken grotendeels vergelijkbaar met respectievelijk clusters 31 en 8 van O. camponoti-rufipedis. Toch waren genen die met deze clusters waren geassocieerd opnieuw ofwel niet aanwezig of verspreid over de genomen van de drie andere soorten die mieren infecteren.

Fylogenie van schimmel-enterotoxinen

Genen die een geannoteerd enterotoxine PFAM-domein (PF01375) en een secretiesignaal bevatten, werden aangegeven als vermeende, uitgescheiden enterotoxinen. Eerdere resultaten en onze huidige studie impliceren dat genen die coderen voor deze vermeende enterotoxines van belang zijn bij gedragsmanipulerende soorten van Ophiocordyceps-schimmels.Deze uitgescheiden bacterie-achtige toxines kunnen mogelijk het gedrag van mieren beïnvloeden door de productie van chemosignaleringsmoleculen in de gastheer te verstoren. Dit werd aangetoond voor enterotoxinen van bacteriële entomopathogenen in seksferomonen van kevers23,24. Ze kunnen echter ook functioneren als louter dodelijke verbindingen25. Bovendien was een van deze vermeende enterotoxinen alleen extreem sterk opwaarts gereguleerd tijdens de gemanipuleerde bijtgebeurtenis18. Dit specifieke gen was aanwezig in alle mieren-manipulerende Ophiocordyceps-soorten in deze studie, evenals in O. australis-Brazil en O. sinensis. Bovendien bleken de mieren-infecterende schimmels een vrij groot aantal genen te hebben die coderen voor deze pathogeniteitsgerelateerde eiwitten. Andere ascomyceten bevatten over het algemeen ofwel veel minder (d.w.z. andere entomopathogenen, nematode-infecterende schimmels en Magnaporthe oryzae) ofwel geen enterotoxinedomein-bevattende genen (d.w.z. de rest van de ascomyceten in deze studie). De genomen van mieren-infecterende Ophiocordyceps-soorten hadden 20-36 vermeende enterotoxinen, waarbij O. australis-Ghana (n = 20) de kleinste had en O. kimflemingiae (n = 36) het grootste aantal. Nematode-infecterende schimmels Ophiocordyceps minnesotensis en Drechmeria coniospora bevatten 19 en 25 genen met een enterotoxine PFAM-domein. Andere entomopathogenen van de orde Hypocreales bevatten slechts 4–16 enterotoxine-annotaties, waarbij Metarhizium robertsii en Cordyceps bassiana de meeste hadden (respectievelijk n = 16 en n = 14). De andere genomen van ascomyceten in deze studie hadden geen genen die voor enterotoxine coderen, behalve de plantpathogeen M. oryzae, die er zes bevatte.

We bouwden een fylogenetische boom op basis van alle schimmelgenen in deze studie die bevatte het PF01375 hitte-labiele enterotoxine alfa-keten domein. Enterotoxinen zijn meestal gemeld voor bacteriesoorten (bijv. Ref. 23,24,25). Daarom hebben we ook vier bacteriële enterotoxinen meegenomen. Dit resulteerde in een boom op basis van 252 domeinregios. We hebben eerst bepaald hoe de enterotoxinen van de bacteriële en plant-infecterende soorten (d.w.z. M. oryzae) zouden clusteren met betrekking tot de meeste dier-infecterende soorten (d.w.z. insecten- en nematode-infecterende schimmels). Dit plaatste drie bacteriële enterotoxinen in één clade en de vierde in een aparte clade (aanvullende figuur S4). Een bacterieel enterotoxine, van Leptospira mayottensis, vormde een outgroup voor de plant-infecterende M. oryzae clade. M. oryzae bevindt zich buiten de orde Hypocreales. Als zodanig werden de plantpathogene enterotoxinen van deze soort gebruikt als een outgroup en werd de boom geroot op L. mayottensis (aanvullende figuur S4). Deze boom toonde aan dat sommige enterotoxinen van mieren-infecterende schimmels verwant zijn aan die van andere insecten- of nematode-infecterende soorten. Andere enterotoxinen vormden hun eigen clades. Binnen deze mierinfectiespecifieke clades werden enterotoxinen van de twee unilateralis-complexe soorten of de australis-complexe soorten vaak gepaard. Ophiocordyceps subramanianii s.l. enterotoxinen vormden vaak de outgroep van een unilateralis- of australis-specifieke clade (aanvullende figuur S4). Bovendien woonde het enterotoxine dat sterk opwaarts werd gereguleerd tijdens gemanipuleerd bijtgedrag (dwz GeneID Ophio5 | 373 aanvullende figuur S4), evenals geconserveerd onder alle miereninfecterende soorten in deze studie (en O. sinensis, zie hierboven), binnen een clade die alleen mieren-manipulerende soorten bevatte. Dit geeft aan dat dit specifieke enterotoxine inderdaad van cruciaal belang zou kunnen zijn bij het vaststellen van gemanipuleerd gedrag zoals waargenomen bij de soorten die in dit onderzoek zijn opgenomen.