Ifølge legenden ble byen Roma grunnlagt i 753 f.Kr. ved bredden av Tiberen, omtrent 25 kilometer fra sjøen ved Ostia. Tiber Island, i sentrum av elven mellom Trastevere og det gamle sentrum, var stedet for et viktig eldgammelt ford og ble senere broet. Legenden sier at Romas grunnleggere, tvillingbrødrene Romulus og Remus, ble forlatt på vannet, der de ble reddet av ulven Lupa.
Elva markerte grensen mellom etruskernes land. mot vest, Sabines i øst og latinene i sør. Benito Mussolini, født i Romagna, justerte grensen mellom Toscana og Emilia-Romagna, slik at Tiberens kilder skulle ligge i Romagna.
Tiberen var kritisk viktig for romersk handel og handel, ettersom skip kunne nå så langt som 100 kilometer oppover. Det er bevis for at det ble brukt til å sende korn fra Val Teverina så lenge siden det 5. århundre f.Kr. Den ble senere brukt til å sende stein, tømmer og næringsmidler til Roma.
Under de puniske krigene på 300-tallet f.Kr. ble havnen i Ostia en nøkkelflåtebase. Den ble senere Roma s viktigste port, hvor hvete, olivenolje og vin ble importert fra Romas kolonier rundt Middelhavet. Kaier ble også bygget langs t han elvebredden i selve Roma, langs elvebredden rundt Campus Martius-området. Romerne koblet elven med et kloakkanlegg (Cloaca Maxima) og med et underjordisk nettverk av tunneler og andre kanaler for å bringe vannet sitt inn i byen.
Velstående romere hadde hageparker eller «horti» på bredden av elven i Roma opp gjennom det første århundre f.Kr. Disse kan ha blitt solgt og utviklet omtrent et århundre senere.
Den tunge sedimenteringen av elven gjorde det vanskelig å opprettholde Ostia, og fikk keiserne Claudius og Trajan til å etablere en ny havn på Fiumicino i det 1. århundre. AD. De bygde en ny vei, via Portuensis, for å koble Roma med Fiumicino, og forlate byen ved Porta Portese («portporten»). Begge havnene ble til slutt forlatt på grunn av silting.
Flere paver forsøkte å forbedre navigasjonen på Tiberen på 1600- og 1700-tallet, med omfattende mudring fortsatte inn på 1800-tallet. Handelen ble styrket en stund, men ved det 20. århundre hadde silting resultert i at elven bare var farbar så langt som selve Roma.
Tiberen var en gang kjent for sine flom – Campus Martius er en flomslette og ville regelmessig flomme til en dybde på 2 meter (6 ft 7 in). Elva er nå begrenset mellom høye steinvoller som ble startet i 1876. Innenfor byen er elvebreddene foret av boulevarder kjent som lungoteveri, gater «langs Tiberen».
Fordi elva er identifisert med Roma , begrepene «å svømme i Tiberen» eller «å krysse Tiberen» har kommet til å være det protestantiske stikkordet for å konvertere til romersk katolicisme. Dette er mest vanlig hvis personen som konverterer hadde vært anglikaner, hvis motsatte refereres til som «svømming av Themsen» eller «kryssing av Themsen».
I det gamle Roma ble henrettede kriminelle kastet i Tiber. Mennesker henrettet ved trappene i Gemonian ble kastet i Tiberen i løpet av den senere delen av keiser Tiberius. Denne praksisen fortsatte gjennom århundrene. For eksempel ble liket av pave Formosus kastet i Tiberen etter den beryktede kadaversynoden som ble holdt i 897.