Hesteskokrabber blir noen ganger kalt «levende fossiler» fordi de har eksistert i en eller annen form i mer enn 450 millioner år. På denne tiden har jorden gått gjennom flere store istider, Great Dying, dannelsen og påfølgende oppbrytning av Pangea, og en asteroideinnvirkning som drepte dinosaurene og det meste av livet på jorden enda en gang. Med andre ord har hesteskokrabber virkelig sett noe dritt.
Likevel vil jeg antar at noen av deres merkeligste opplevelser må ha kommet i løpet av de siste tiårene, som en av de myke kroppene kom etter at dinosaurer begynte å bruke hendene til å øse hesteskokrabber ut av havet i massevis. Moderne mennesker dreper ikke bevisst hesteskokrabber – som tidligere hundrevis av bønder som fanget dem for gjødsel, eller fiskere som brukte dem som agn. I stedet skrubber de krabber rene for fuglehorn, bretter hengslede karapasser og stikker rustfritt stål el nåler til et mykt, svakt sted for å trekke blod. Hesteskokrabbeblod går blått og ugjennomsiktig, som frostvæske blandet med melk.
Og til hva trenger mennesker egentlig blodet fra et levende fossil? En slags hekseri, kan du si, for det holder bokstavelig talt folk i live. Horseshoe-crab blood er utsøkt følsom for giftstoffer fra bakterier. Den brukes til å teste for forurensning under fremstilling av alt som kan komme inn i menneskekroppen: hvert skudd, hvert IV-drypp og hvert implantert medisinsk utstyr.
Den moderne biomedisinske industrien er så avhengig av dette blodet at forsvinning av hesteskokrabber umiddelbart vil forringe den. Og de siste årene har hesteskokrabber, særlig i Asia, blitt utsatt for en rekke trusler: tap av habitat ettersom havveggene erstatter strendene der de gyter, forurensning, overfiske for bruk som mat og agn. Horseshoe krabber blødd for biomedisinsk bruk i USA returneres til havet, men anslagsvis 50.000 dør også i prosessen hvert år.
Det er imidlertid en annen måte – en måte for moderne medisin å bruk moderne teknologi i stedet for blodet fra et eldgammelt dyr. En syntetisk erstatning for hestesko-krabbeblod har vært tilgjengelig i 15 år. Dette er en historie om hvordan forskere stille klarte å overgå millioner av år med evolusjon, og hvorfor det har tatt resten av verden så lang tid å ta igjen.
Flere historier
Jeak Ling Ding sier at hun var «alltid en labrotte» – den typen biolog som hadde på seg hvite strøk i stedet for den typen som vasset inn i gjørme. Likevel, i midten av 1980-årene, fant hun seg i å smelte gjennom gjørme på jakt etter hesteskokrabber. elvemunningen der de bodde, husker hun på diskret måte, var «ikke veldig søt luktende i det hele tatt.»
Ding, sammen med mannen sin og forskning partner Bow Ho, hadde kommet til hesteskokrabber kretsløp, og deres endelige mål var å gjøre dyrene ikke lenger nødvendige i biomedisinsk forskning. På den tiden var hun molekylærbiolog ved National University of Singapore, og sykehusets in vitro-befruktningsavdeling hadde kommet til Ding og Ho med et problem: Deres embryoer ville ikke overleve lenge nok – kan det være på grunn av bakteriell forurensning ?
En standard test på den tiden – og nå – er LAL, som står for limulus amebocyte lysate. Limulus refererer til Limulus polyphemus, arten av hesteskokrabbe som er hjemmehørende i Atlanterhavskysten i Nord-Amerika. Amebocyte refererer til celler i krabbens blod. Og lysat er materialet som er frigjort fra cellene når de først er «lysert» eller ødelagt. Dette er tingene som er veldig følsomme for bakterietoksiner.
Den første personen som fant ut dette om LAL var Frederik Bang. Tretti år før Ding – og 9000 mil unna på Cape Cod – samlet han også hesteskokrabber i fjæra. (Av grunner som ikke er helt forstått, finnes hesteskokrabber bare rundt østkysten av Nord-Amerika og Asia.) Bang, en patolog, var interessert i skapningens primitive immunsystem. Han la til grunn en protokoll for å injisere bakterier fra sjøvann direkte i hesteskokrabber, som får blodet til å klumpe seg sammen i «strenge masser.»
Bang mistenkte at denne koaguleringen hadde et formål. Det immobiliserte bakteriene, og forseglet resten av hesteskoekroppen fra et invaderende patogen. Spennende ble blodet deres til gel, selv om han først kokte bakterieinjeksjonen i fem eller ti minutter. Dette burde ha drept bakteriene og sterilisert den injiserte løsningen. Bang innså at blodet ikke var følsomt for levende bakterier, men for bakterietoksiner som vedvarer selv etter sterilisering.
Det menneskelige immunforsvaret kan være mye mer sofistikert enn hesteskokrabber, men det reagerer også på disse giftstoffene. Legene skjønte dette først på slutten av 1800-tallet, hvor pasienter som fikk sterile skudd likevel kom ned med «injeksjonsfeber» eller «saltvannsfeber.» I verste tilfeller kan toksinene forårsake septisk sjokk og til og med død.
På det tidspunktet Bang gjorde denne undersøkelsen på 1950-tallet, var den vanlige måten å teste bakterietoksiner på å injisere en prøve i kaniner. Det krevde at noen kom og sjekket kaninenes temperatur hvert 30. minutt i tre timer for tegn på feber, noe som antyder bakteriell forurensning.
Under mikroskop, hadde kaninens blodceller også en tendens til å klumpe seg rundt toksinet, en likhet som Bang bemerket i hans papir fra 1956 om hesteskokrabbeblod. I løpet av det neste halvannet tiåret utviklet han og en ung patolog ved navn Jack Levin en standardisert måte å utvinne LAL på. Det var imidlertid først i 1977 at Food and Drug Administration tillot farmasøytiske selskaper å erstatte sine store kolonier av kaniner med LAL-sett. Nå la du ganske enkelt LAL til det testede materialet og snudde hetteglasset for å se om det ble solid – mye raskere og mer praktisk. LAL-testen krevde fortsatt bruk av dyr, men den grusomme prosessen med å stikke nåler i dyr ble skjult og outsourcet til en annen del av forsyningskjeden.
Da Ding lette etter hesteskokrabber i Singapore , LAL hadde blitt en millionindustri. En kvart hestesko-krabbeblod er angivelig verdt så mye som $ 15.000. Og LAL-settene hun trengte for å teste forurensning av IVF-embryoer var altfor dyre. Ett sett, husker hun, kostet $ 1000 for henne i Singapore.
Derfor vurderte hun å lage sitt eget lysat. Men hesteskokrabbearten hun studerte i Singapore, Carcinoscorpius rotundicauda, er mye mindre enn atlantiske hestekrabbe, og de kunne ikke blødes mye uten å dø. Så Ding satte seg for å lage et alternativ til LAL som til slutt ikke ville kreve hesteskokrabber i det hele tatt.
Det som kreves var å manipulere DNA. Hennes idé var å splitte hestesko-krabbegenet som er ansvarlig for LALs gift-jaktevne i celler som vokser lett i et laboratorium, som gjær. Bioteknologi som felt beveget seg allerede i retning av rekombinant DNA, som innebærer å ta DNA fra en art og sette den en annen. Noen år tidligere i 1982 begynte Eli Lilly å selge humant insulin dyrket i kar av bakterier.
Ding hadde et godt utgangspunkt for sitt LAL-alternativ. Da hadde forskere identifisert faktor C, det spesifikke molekylet i LAL som oppdager bakterietoksiner. Så hun begynte å jakte på genet som lager faktor C. Forskningsteamet hennes tok celler fra hesteskokrabber som de samlet og blødde dem minimalt. (De prøvde også, men mislyktes, i å dyrke hesteskokrabber i et laboratorium og avle dem gjennom IVF.)
Hestehovekrabbens følsomhet overfor bakterietoksiner dessverre gjorde det også vondt å studere. Giftene viser seg at de er overalt — i vann, i prøverør, i petriskåler. «Du må bake alt bakbart glass ved 200 til 220 grader i flere timer.» sier Ding. De måtte også kjøpe spesielt vann som hadde blitt behandlet for å være giftfritt med bakterier. Hvis du ikke var forsiktig, kunne løsningsrøret ditt lett bli gel.
Når Ding og Ho endelig identifiserte genet for faktor C, skjøt de det i gjær. Det mislyktes fordi mens gjæren laget faktor C, skilt det ikke ut molekylet. «Gjæren var veldig vanskelig å bryte opp. Det var veldig urent og rotete, sier hun. De prøvde en annen type gjær- og pattedyrceller – de mislyktes også. På slutten av 1990-tallet deltok Ding og Ho på et kurs i USA og lærte om baculovirusvektorsystemer. Her brukes et virus for å sette faktor C inn i insekt tarmceller, og gjøre dem til små fabrikker for molekylet. Insekter og hestesko har en felles evolusjonær avstamning: De er begge leddyr. Og disse cellene fungerte fantastisk.
Endelig, et og et halvt tiår etter at hun begynte, hadde Ding et alternativ til LAL som fungerte uten å skade mer. hesteskokrabber. Hun cooped seg opp i biblioteket for å studere patenter og utarbeidet søknaden selv. Så sendte hun den av og ventet på at verden skulle endre seg.
Verden endret seg ikke, i det minste ikke på hesteskokrabbene. Det tok tre år før det første rekombinante faktor C-testpakket basert på Dings patent kom ut i 2003, men selv da viste farmasøytiske selskaper liten interesse.
Bedriftene hadde en rekke årsaker. Det var bare én leverandør av settet, et selskap som i dag er en del av det sveitsiske baserte kjemikalieselskapet Lonza. Farmasøytiske selskaper var skeptiske til å stole på en enkelt kilde for en så viktig del av produksjonen. Hva om noe skjedde med Lonza?Eller rammet en naturkatastrofe produksjonsanlegget? Bedrifter som bløder krabber taper også mye penger hvis faktor C blir adoptert mye. Av de seks selskapene med krabbeblødningsanlegg i USA avviste to intervjuer, ett svarte ikke på en intervjuforespørsel, og to har praktisk talt ingen offentlig tilstedeværelse. Den sjette er Lonza, som for tiden selger både LAL og den rekombinante faktoren.
Lonza ga på sin side skylden for det langsomme opptaket av regelverk. I USA forteller FDA selskaper som utfører bakterietoksintester for å følge United States Pharmacopeia, en håndbok som inneholder legemiddelstandarder. I en 2012-veiledning sa FDA at selskapene kunne bruke rekombinant faktor C, som ikke vises i Pharmacopeia, hvis de utførte sine egne valideringstester. «Risikoen er at FDA selvfølgelig ikke godtar valideringen din, og at du ikke kan bringe produktet ditt på markedet,» sier Lonzas talsmann Katrin Hoeck. «Farmasøytiske selskaper er risikovillige.» Det tok industrien flere tiår å flytte fra kaniner til LAL også.
Virksomhetens virkeligheter kom som en skuffelse for Ding. «Vi var bare så ivrige som forskere, så glade for at det fungerer,» sier hun. «Og vi trodde den rekombinante faktoren C ville bli adoptert over hele verden, og hesteskokrabben ville bli reddet.»
Nylig har imidlertid noen få ting endret den ferske beregningen av risikobelønning for farmasøytiske selskaper. For det første er ikke Lonza lenger eneleverandør. I 2013 ble Hyglos det andre selskapet som laget rekombinant faktor C. Kevin Williams, seniorforsker ved Hyglos, sier at han ser på som en lenge forsinket modernisering: Farmasøytiske selskaper sluttet å stole på griser og begynte å lage insulin i gjær og bakterieceller for flere tiår siden. Hvorfor kan ikke samme teknologi brukes på selve testen som ble brukt for å kontrollere at insulin er trygt for injeksjon?
På den regulatoriske siden la European Pharmacopoeia til rekombinant faktor C som en akseptert bakterietoksintest i 2016, og banet vei for endring i USA. En rekke farmasøytiske selskaper, spesielt Eli Lilly, har sammenlignet effektiviteten av rekombinant faktor C og LAL.
Jay Bolden, en ekspert på bakteriell toksindeteksjon hos Eli Lilly, husker at Lonza kom i laboratoriene sine med det rekombinante faktor C-settet for over ti år siden. Han var fascinert på den tiden, men ennå ikke villig til å ta steget. Vendepunktet kom i 2013, da Eli Lilly begynte å planlegge et insulinproduksjonsanlegg i Kina, der de innfødte hesteskokrabbeartene har gått ned. «Du vil høre ting om en dag at hesteskokrabben kan bli begrenset,» sier Bolden. Derimot så forsyningskjeden for rekombinant faktor C tryggere ut med både Hyglos og Lonza som leverandører. LAL og faktor C er også sammenlignbare i kostnad. / p>
Bolden sier at Eli Lilly bestemte seg for å «trekke en linje i sanden»: Alle nye produkter etter et visst punkt ville bli testet med rekombinant faktor C. Selskapet sendte nylig inn til FDA sin første søknad om et medikament – galcanezumab for å forhindre migrene – der det endelige medikamentet vil bli kvalitetstestet med faktor C. Det har også sett på bruk av rekombinant faktor C under produksjonsprosessen for å teste vann og utstyr, som for tiden står for det store flertallet av LAL-bruk. Bolden sier at Eli Lilly har lobbyvirksomhet i US Pharmacopeia for å inkludere rekombinant faktor C.
Torsdag vil Bolden tale i Cape May, New Jersey, på et arrangement organisert av Revive & Restore, en ideell organisasjon som er best kjent for sitt arbeid med å bringe utdøde arter tilbake til livet. «Vårt oppdrag er å bruke bioteknologi til bevaring,» sier Ryan Phelan, medstifter og administrerende direktør i Revive & Restore. Phelan møtte Ding først da hun reiste til Singapore for en syntetisk -biologikonferanse i 2017, og hun innså at forskningen på rekombinant faktor C satt perfekt i skjæringspunktet mellom bevaring og bioteknologi.
Revive & Restore og dets bevaringspartnere – New Jersey Audubon, American Littoral Society og Delaware River Keeper Network – valgte Cape May-stedet fordi hesteskokrabber kommer hit hver vår for å gyte. Du kan ikke lenger fange hestesko krabber her på grunn av deres betydning for en truet trekkfugleart som kalles den røde knuten. Disse fuglene dukker også opp her om våren. Trekkingen deres er tidsbestemt slik at fugler som flyr fra Sør-Amerika til Arktis kan kløve seg på kaviarlignende hesteskokrabbeegg. Strendene blir svarte av krabber, deres hun Det klikker i klap mens hunnene klatrer for å legge eggene og hannene for å gjødsle dem.De røde knutene kryper for å spise. De dobler nesten i vekt for reisen til Arktis.
Det er en eldgamle synkronisering mellom arter, en som begynte lenge før mennesker begynte å høste hesteskokrabber etter blod og vil forhåpentligvis vare lenge etter.