Antinfekserende Ophiocordyceps-genom avslører et stort mangfold av potensielle atferdsmanipulasjonsgener og en mulig hovedrolle for enterotoksiner

Genomfunksjoner

Ophiocordyceps-utkast genomene generert i denne studien (Tabell 1) ble samlet med avlesninger generert over forskjellige sekvenseringskjøringer ved bruk av to typer DNA-biblioteker. Bare løpene som førte til høykvalitetslesninger ble brukt til montering (se Materialer og metoder). Contig-montering resulterte i genomstørrelser fra 21,91-23,92 millioner basepar (Mbp) for O. unilateralis s.l. og O. australis s.l. arter. I kontrast, O. subramanianii s.l. hadde en estimert genomstørrelse på 32,31 Mb. Genforutsigelse ga mellom 7621 og 8629 gener for O. unilateralis og O. australis-arten. Ophiocordyceps subramanianii s.l. ble spådd å ha 11 275 gener. I tillegg er GC-innhold i O. subramanianii s.l. (dvs. 60,35%) var mye høyere sammenlignet med de andre Ophiocordyceps-artene i denne studien (54,66% + / – 1,57%) (Tabell 1).

Vi forbedret også forsamlingen og genet prediksjon av det tidligere publiserte genomet til O. unilateralis sl stamme SC16a (supplerende tabell S1), som nå har mottatt artsnavnet O. kimflemingiae 20. I tillegg til å være mindre fragmentert, er den nye forsamlingen mindre enn tidligere rapportert18. Dette er mest sannsynlig på grunn av en bedre samling av repeterende regioner, som ble funnet høyest i unilateralis-arten (6,59-6,83%) sammenlignet med de andre ant-infiserende artene i denne studien (tabell 1). Til tross for den mindre forsamlingsstørrelsen økte den nye genforutsigelsen genantallet med 798 gener. Denne økningen er overveiende forårsaket av spådommer av færre kimærer (dvs. nabogener som er feil sammenslått i en genmodell) ved bruk av Braker1-rørledningen (data ikke vist). denne studien ble genet prediksjon informert av RNA-Seq leser. For den tidligere rapporterte nordamerikanske unilateralis-arten O. kimflemingiae, leses generert i den tidligere studien ble brukt18. Gjennom vanskeligheter med å dyrke brasiliansk O. camponoti-rufipedis ble det ikke oppnådd nok materiale for å generere RNA-Seq-data i tillegg til DNA-avlesningene som trengs for å oppnå et utkast genom. Fordi både O. kimflemingiae og O. camponoti-rufipedis ligger innenfor samme artskompleks (unilateralis), forsøkte vi å kartlegge den nordamerikanske unilateralis-arten som ble lest til O. camponoti-rufipedis-genomet for å se om de kunne brukes til å informere om kommentar. Imidlertid, mens 93% av O. kimflemingiae leser kartlagt til sitt eget genom, er bare 43% kartlagt til O. camponoti-rufipedis genomet (tilleggstabell S2). Vi har i tillegg kartlagt lesningene til en annen publisert O. unilateralis s.l. genomet, det fra O. polyrhachis-furcata 22, for å bestemme om dette ville være en mer generell krysskartningseffekt eller spesifikk for O. camponoti-rufipedis-genomet. En tilsvarende kartlegging på 41% resulterte. Dette antyder at unilateralis-arter generelt kan være ganske fjernt beslektede, noe som gjør kryss-kartlegging for å informere kommentar mindre passende. For informative formål kartla vi også australis-artene med hverandre (stammer MAP-64 fra Brasil og 1348a fra Ghana). Dette resulterte i 71% og 82% kryss-kartlagt lesning versus 86% og 97% kartlagt til henholdsvis sine egne genomer (tilleggstabell S2). Dette innebærer at arter i australiskomplekset dermed sannsynligvis er mye nærmere knyttet til hverandre enn arter i unilateralis-komplekset.

Ortologiske klynger

Vi satte oss for å undersøke hvilke genforutsigelser av de maurinfiserende Ophiocordyceps-artene i denne studien er sannsynligvis konservert og delt med andre ascomycetes. I tillegg hadde vi som mål å oppdage hvilke artsspesifikke og «manipulasjonsspesifikke» spesialiseringer som kunne ha funnet sted. Som sådan ble de spådde proteomene til våre fem antinfeksjons sopper sammenlignet med de 18 andre ascomycetous soppene. Av disse artene var ti var dyreparasitter (to infiserende pattedyr, to infiserende nematoder og seks infiserende insekter) og 13 ligger i samme rekkefølge (Hypocreales). Fire arter tilhørte samme familie (Ophiocordycipitaceae) og to var innenfor samme slekt (Ophiocordyceps). fylogenetisk rekonstruksjon basert på 67 konserverte gener tilstede i hver av disse organismer er avbildet i figur 2.

Totalt 51.012 ortologiske klynger inkluderte alle kommenterte proteiner av hver av de 23 ascomycetene som er inkludert i denne analysen (Supplementary Data S1). Oppsummeringsstatistikk angående denne klyngingen finnes i tilleggs figur S1. Vi sammenlignet overlapping av ortologiske klynger mellom tre artsområder: 1) de maurinfiserende soppene, som omfattet alle de fem utkastgenomene som ble generert i denne studien, 2) de andre insektinfiserende soppene Ophiocordyceps sinensis, Tolypocladium inflatum, både Metarhizium og begge Cordyceps-arter og 3) alle ikke-insektinfiserende ascomycetes, som inkluderte andre dyreinfiserende, planteinfiserende, soppinfiserende og saprofytiske sopp. Resultatene av denne analysen er avbildet i Venn-diagrammet i fig. 3a. Deretter utførte vi anrikningsanalyser for de funksjonelle merknadene av antinfiserende artsgener som ble funnet innenfor de forskjellige overlappende og ikke-overlappende delene av diagrammet. Av de 7 931 ortologiske klyngene som ble funnet innenfor alle de tre artsområdene, var Gene Ontology (GO) -kommentarer for generelle biologiske prosesser betydelig overrepresentert. Dette antyder, som man kan forvente, at ascomycetes med forskjellige livsstiler bruker lignende mekanismer for generelle prosesser som transkripsjon, translasjon, proteintransport og signaltransduksjon. Imidlertid var gener spådd å kode for (små) utskilte proteiner, proteiner med GO-merknader for multiorganismeprosesser og patogenese, og mer spesifikt, utskilt antatte enterotoksiner, var underrepresentert. Når vi utførte en anrikningsanalyse av merknader som var til stede i ortologiske klynger som bare ble funnet i den antinfiserende arten (dvs. 6672 klynger, fig. 3a), fant vi det motsatte resultatet. GO-merknader for (stort sett de samme) generelle biologiske prosessene var signifikant underrepresentert, mens (små) utskilt proteiner, proteiner med GO-merknader for multiorganismeprosesser og patogenese, og antatte enterotoksiner var overrepresentert. Dette antyder at en betydelig del av hemmeligheten til de maurinfiserende soppene i denne studien er spesifikk for dem. Denne spesifisiteten dukket opp delvis på grunn av enterotoksiner som er en del av sekretome og bioaktive små sekreterte proteiner (SSP) som kan være viktige i sopp-maur interaksjoner. (Små) sekreterte proteiner var også overrepresentert blant klyngene som antinfiserende sopp utelukkende delte enten med andre entomopatogener (262 klynger) eller ikke-entomopatogener (449 klynger). Dette indikerer at deres sekretomer også inneholder mer generelle entomopatogen-spesifikke proteiner, så vel som proteiner som deles utelukkende med ikke-entomopatogene ascomycetes.

Vi undersøkte også hvordan ortologiske klynger, som bare ble funnet blant de maurinfiserende soppene, ble representert av disse artene (fig. 3b). Av de totalt 6 672 klyngene i denne sammenligningen syntes 90,6% å være artsspesifikk. Klyngeoverlapping var således marginal selv om alle arter i denne studien ligger innenfor samme slekt (Ophiocordyceps) og i noen tilfeller til og med innenfor samme artskompleks (O. unilateralis s.l. og O. australis s.l.). Analysering av berikelse av funksjonelle merknadsbetingelser i disse artsspesifikke klyngene resulterte igjen i overrepresentasjoner av (små) utskilte proteiner. Selv om det var marginalt, ble de fleste klyngeoverlappinger funnet mellom nærmere beslektede arter innenfor samme kompleks (dvs. O. australis s.l., 289 klynger og O. unilateralis s.l., 182 klynger Fig. 3b). Også her avslørte anrikningsanalyser en overrepresentasjon for (små) utskilte proteiner. Dermed ser det ut til at en statistisk signifikant mengde av soppsekretomet til disse antinfiserende artene enten er kompleks eller artsspesifikk. I tillegg fant vi en overrepresentasjon av patogenisitets GO-termer blant de kompleksspesifikke ortologiske klyngene. Dette funnet kan tilskrives tilstedeværelsen av ortologiske enterotoksiner i arter i samme kompleks.Bare fire klynger som ikke var tilstede i noen av de andre ascomycetene i vår sammenligning ble delt mellom alle fem antinfeksjonsarter (figur 3b). Ingen av disse fire klyngene fikk en funksjonell merknad, men tre av dem inneholdt gener med forutsagte sekresjonssignaler. For tre av de fire klyngene resulterte en BLASTp-analyse av genene mot NCBI-databasen utelukkende i hypotetiske proteintreff med den tidligere avsatte versjonen av O. kimflemingiae genomet18. Dette indikerer at disse klyngene faktisk kan representere proteiner som er unike for antinfiserende Ophiocordyceps-arter. Proteinsekvenser i den fjerde klyngen resulterte i treff med metalloproteaser i tillegg til å tilpasse seg igjen med et hypotetisk protein fra O. kimflemingiae (XA68_3159), (tilleggstabell S3). Denne klyngen kan således inneholde formodede metalloproteaser som bare finnes i genomene til den antinfiserende sopparten som er undersøkt her. Videre ble bare to av klyngene funnet unikt i de maurinfiserende soppene delt mellom alle fire artene som induserer bitteatferd (figur 3b). En BLASTp-analyse av genene i disse klyngene resulterte igjen i hypotetiske proteintreff med den tidligere avsatte versjonen av O. kimflemingiae genomet18 (Supplerende tabell S4).

Kandidatmanipulasjonsgener involvert i å etablere bitteatferd

Vi analyserte bevaring av kandidatgener assosiert med den manipulerte bitende hendelsen observert i infiserte maur. Vi brukte tidligere publiserte transkriptomikkdata18 og bestemte på nytt differensialgenekspresjon ved å kartlegge dataene til den nye versjonen av genomet O. kimflemingiae. I henhold til den tidligere publiserte studien fulgte vi resonnementet om at kandidatgener, involvert i å etablere manipulert bitende atferd, ville bli oppregulert under denne hendelsen og raskt nedregulert igjen etter. Som sådan ble 547 kandidatgener identifisert, noe som er 49 mer enn rapportert i forrige analyse18. I tråd med de tidligere rapporterte dataene var gener involvert i DNA-replikering, oksidasjonsreduksjonsprosesser, sekresjon og sekundær metabolisme overrepresentert.

Konservering av kandidatmanipulasjonsgener ble også analysert ved hjelp av ortologisk gruppering. Vi sammenlignet overlapping av ortologiske klynger som inneholder de kandidatgenene, som var signifikant opp- under og nedregulert etter manipulert bitende oppførsel i O. kimflemingiae, med tre artsområder: 1) de andre maurinfiserende soppene, som omfattet de fire nye utkastene genomer generert i denne studien, 2) de andre insektinfiserende soppene, og 3) alle ikke-insektinfiserende ascomycetes brukt til sammenligning tidligere. Resultatene av denne analysen er avbildet i Venn-diagrammet i figur 4. Av kandidatmanipulasjonsgenene så 78% ut til å være ortologer av gener som er tilstede i alle de andre tre artsområdene (dvs. 423 klynger, figur 4). Dette innebærer at genene som uttrykkes under manipulert bitt indusert av O. kimflemingiae, sannsynligvis ikke er spesifikke for manipulasjon. Blant disse bredt delte gener var CYPer og andre oksidasjonsreduksjonsrelaterte funksjoner overrepresentert, så vel som gener som koder for utskilte proteiner og proteaser. Forskjellige sekundære metabolisme-merknader (klynger 7,8 og 9) var også overrepresentert blant disse bredere delte ortologiske klyngene. De omfattet en tryptofandimetylallyltransferase involvert i ergot alkaloid-syntese, forskjellige cytokromer, små utskilte proteiner, en polyketidsyntase (PKS) og en PKS-NRPS (ikke-ribosomalt proteinsyntetase) hybrid. Blant kandidatmanipulasjonsgenene som så ut til å være unike for O. kimflemingiae (dvs. 59 klynger, fig. 4), var bare SSP-er overrepresentert. Imidlertid mottok 92% av disse «unike» genene ikke en funksjonell kommentar. Der det ble funnet noen annen overlapping med de tre artsområdene, var SSP-er også overrepresentert, i likhet med større utskilte proteiner. Av de som bare var til stede i antinfeksjon sopp (dvs. 24 klynger Fig. 4), igjen mottok ikke flertallet (79%) en funksjonell kommentar. Blant de syv ortologiske klyngene som var til stede i alle insektinfiserende arter, men ikke i andre ascomycetes, fant vi en antatt, utskilt enterotoksin. Dette enterotoksinet var tilstede i den bitende atferdsinduserende arten O. kimflemingiae (to ortologer), O. camponoti-rufipedis (1 ortolog), O. subramanianii sl (to ortologer) og O. australis-Ghana (to ortologer) , så vel som i O. australis-Brazil og O. sinensis. Dessuten viste en av de to enterotoksinortologene i O. kimflemingiae et dramatisk uttrykksmønster med et > 3000 ganger opp -regulering under manipulasjon og en 200-fold nedregulering etter18. Dette enterotoksinet kan således potensielt være en viktig nøkkelaktør i etableringen av atferdsmanipulasjon av disse Ophiocordyceps-artene.

Konservering av sekundære metabolittklynger

En generell hypotese er at endret vertsadferd etableres gjennom sekresjon av sekundære metabolitter i tillegg til større bioaktive forbindelser . Denne hypotesen støttes av overrepresentasjonen av visse kommenterte sekundære metabolittklynger blant gener av O. kimflemingiae som er oppregulert under manipulert bitteatferd18. Når vi undersøkte disse nærmere, fant vi at genene, innenfor, men også direkte flankerende de merkede sekundære metabolittklyngene, fulgte dette spesielle uttrykksmønsteret (figur 5a). Vi spurte om disse klyngene ble bevart blant insektinfiserende Ophiocordyceps sopp. Dette antyder en likhet i bruk av sekundære metabolitter av disse soppene for å samhandle med deres maurverter for å etablere den observerte manipulerte oppførselen. Som sådan undersøkte vi kommenterte klynger 7,8 og 9 av O. kimflemingiae og deres direkte flankerende gener. Disse klyngene 1) ble oppregulert under manipulert bitteatferd etterfulgt av en betydelig nedregulering, og 2) delte ortologer med andre ascomycetes (se ovenfor). For genene i disse klyngene søkte vi etter homologer (BLASTp-justering) og ortologer (ortologisk klynging) i de andre fire antinfiserende soppene (figur 5b og tilleggsfigur S3). Dette demonstrerte at unilateralis-arten organiserte i det minste noen av deres sekundære metabolisme-relaterte gener i stort sett like klynger. De andre Ophiocordyceps-artene hadde homologer og ortologer av disse sekundære metabolismegenene spredt gjennom genomene sine eller inneholdt ikke en kopi i det hele tatt (figur 5b og tilleggsfigur S3). For eksempel inneholdt kommentert klynge 8 i O. kimflemingiae en tryptofandimetylallyltransferase flankert av oksidasjonsreduksjonsrelaterte CYPer og et gen med et FAD-bindende domene. Denne klyngen flankeres direkte av syv gener som fulgte et lignende uttrykksmønster (fig. 5a). O. camponoti-rufipedis genomet hadde denne tryptofan dimetylallyltransferase på en lignende måte; flankert av CYP og et FAD-bindende gen, etterfulgt av homologer og ortologer av de nærliggende genene (fig. 5b). O. subramanianii s.l. genomet hadde også en lignende tryptofandimetylallyltransferase. Det ble imidlertid flankert av ikke-homologe / ortologe CYP- og FAD-bindende gener. Faktisk er O. subramanianii s.l. hadde homologer / ortologer av disse genene, men de bodde på helt forskjellige contigs, som gjorde genene rett utenfor den kommenterte sekundære metabolittklyngen (fig. 5b). Videre hadde begge australis-artene ikke et ortologt / homologt gen som koder for denne spesielle tryptofandimetylallyltransferase. Faktisk så det ut til at australis-arten fra Ghana ikke inneholdt en antatt tryptofandimetylallyltransferase i det hele tatt. Lignende konklusjoner kan gjøres når man analyserer de andre sekundære metabolittklyngene (tilleggsfigur S3). Klyngene 7 og 9 fra O. kimflemingiae virket stort sett sammenlignbare med henholdsvis klyngene 31 og 8 fra O. camponoti-rufipedis. Likevel var gener assosiert med disse klyngene igjen enten ikke til stede eller spredt over genomene til de tre andre antinfeksjonsartene.

Fylogeni av sopp-enterotoksiner

Gener som inneholdt et kommentert enterotoksin PFAM-domene (PF01375) og et sekresjonssignal ble indikert som antatte, utskilt enterotoksiner. Tidligere resultater og vår nåværende studie impliserer at gener som koder for disse antatte enterotoksinene, er av betydning for atferdsmanipulerende arter av Ophiocordyceps-sopp.Disse utskilles bakterielignende giftstoffer kan potensielt påvirke maurens oppførsel ved å forstyrre produksjonen av kjemosignaleringsmolekyler i verten. Dette ble demonstrert for enterotoksiner fra bakterielle entomopatogener i kjønnsferomoner av bollevevler 23,24. De kan imidlertid også fungere som bare drepende forbindelser25. I tillegg var en av disse formodede enterotoksinene ekstremt sterkt oppregulert bare under den manipulerte bitehendelsen18. Dette spesielle genet var til stede i alle antimanipulerende Ophiocordyceps-arter i denne studien, så vel som O. australis-Brazil og O. sinensis. Videre så det ut til at de maurinfiserende soppene hadde et ganske stort antall gener som koder for disse patogenisitetsrelaterte proteiner. Andre ascomycetes inneholdt generelt enten langt færre (dvs. andre entomopatogener, nematodeinfiserende sopp og Magnaporthe oryzae) eller ingen enterotoksindomenholdige gener (dvs. resten av ascomycetene i denne studien). Genomene til antinfiserende Ophiocordyceps-arter hadde 20–36 antatte enterotoksiner med O. australis-Ghana (n = 20) med det minste og O. kimflemingiae (n = 36) med det største antallet. Nematodeinfiserende sopp Ophiocordyceps minnesotensis og Drechmeria coniospora inneholdt 19 og 25 gener med et enterotoksin PFAM-domene. Andre entomopatogener av rekkefølgen Hypocreales inneholdt bare 4–16 enterotoksin-merknader, hvor Metarhizium robertsii og Cordyceps bassiana hadde flest (henholdsvis n = 16 og n = 14). De andre ascomycete-genomene i denne studien hadde ikke noen enterotoksinkodende gener, bortsett fra plantepatogenet M. oryzae, som inneholdt seks.

Vi bygde et fylogenetisk tre basert på alle soppgenene i denne studien som inneholdt PF01375 varmelabilt enterotoksin alfa kjededomen. Enterotoksiner er for det meste rapportert for bakteriearter (f.eks. Ref 23,24,25). Vi inkluderte derfor også fire bakterielle enterotoksiner. Dette resulterte i et tre basert på 252 domeneregioner. Vi bestemte oss først for hvordan enterotoksiner fra bakterie- og planteinfeksjonsarter (dvs. M. oryzae) ville klynges med hensyn til flertallet av dyr-infiserende arter (dvs. insekt- og nematodeinfiserende sopp). Dette plasserte tre bakterielle enterotoksiner i en klade, og den fjerde i en egen klade (tilleggsfigur S4). Ett bakterielt enterotoksin, fra Leptospira mayottensis, dannet en utgruppe for den planteinfiserende M. oryzae-kladen. M. oryzae bor utenfor ordren Hypocreales. Som sådan ble plantens patogene enterotoksiner ved denne arten brukt som en utegruppe, og treet var rotfestet på L. mayottensis (tilleggsfigur S4). Dette treet viste at noen enterotoksiner av myreinfiserende sopp er relatert til de fra andre insekt- eller nematodeinfiserende arter. Andre enterotoksiner dannet sine egne klader. Innenfor disse antinfeksjonsspesifikke kladene ble enterotoksiner fra de to unilateralis-komplekse artene eller australis-komplekse artene ofte paret. Ophiocordyceps subramanianii s.l. enterotoksiner dannet ofte utgruppen til en ensidig eller australis-spesifikk klade (Supplerende figur S4). I tillegg bodde enterotoksinet som var høyt oppregulert under manipulert bitende atferd (dvs. GeneID Ophio5 | 373 Supplerende figur S4), samt konservert blant alle antinfeksjonsarter i denne studien (og O. sinensis, se ovenfor). innenfor en klade som bare inneholdt antimanipulerende arter. Dette indikerer at dette bestemte enterotoksinet virkelig kan være av nøkkel viktig for å etablere manipulert atferd som observert hos artene som er inkludert i denne studien.