개미 감염 Ophiocordyceps 게놈은 매우 다양한 잠재적 행동 조작 유전자와 장 독소의 가능한 주요 역할을 보여줍니다

유전체 특징

이 연구에서 생성 된 Ophiocordyceps 초안 게놈 (표 1)은 두 가지 유형의 DNA 라이브러리를 사용하여 다양한 시퀀싱 실행에서 생성 된 읽기로 조립되었습니다. 고품질 판독으로 이어진 실행 만 조립에 사용되었습니다 (재료 및 방법 참조). Contig 어셈블리는 O. unilateralis s.l.에 대해 21.91 ~ 2,392 백만 염기쌍 (Mbp) 범위의 게놈 크기를 생성했습니다. 및 O. australis s.l. 종. 대조적으로, O. subramanianii s.l. 추정 게놈 크기는 32.31 Mb입니다. 유전자 예측은 O. unilateralis와 O. australis 종에 대해 7,621에서 8,629 개의 유전자를 산출했습니다. Ophiocordyceps subramanianii s.l. 11,275 개의 유전자가있을 것으로 예측되었습니다. 또한 O. subramanianii s.l. (즉, 60.35 %)이 연구에서 다른 Ophiocordyceps 종 (54.66 % +/- 1.57 %)에 비해 훨씬 더 높았습니다 (표 1).

또한 이전에 발표 된 O의 게놈 조립 및 유전자 예측을 개선했습니다. 일방적 sl 현재 종 이름 O. kimflemingiae 20을받은 균주 SC16a (보충 표 S1). 단편화가 적을뿐만 아니라 새 어셈블리는 이전에보고 된 것보다 작습니다 18. 이것은이 연구에서 다른 개미를 감염시키는 종에 비해 unilateralis 종 (6.59–6.83 %)에서 가장 높은 반복 영역의 더 나은 집합 때문일 가능성이 큽니다 (표 1). 더 작은 어셈블리 크기에도 불구하고 새로운 유전자 예측은 798 개의 유전자로 유전자 수를 증가 시켰습니다. 이러한 증가는 주로 Braker1 파이프 라인 (데이터는 표시되지 않음)을 사용하여 더 적은 수의 키메라 (즉, 하나의 유전자 모델로 잘못 병합 된 인접 유전자)의 예측으로 인해 발생합니다.

이 연구에서 유전자 예측은 RNA-Seq 판독에 의해 알려졌습니다. 이전에보고 된 북미 일 방성 종 O. kimflemingiae의 경우 이전 연구에서 생성 된 판독 값이 사용되었습니다 18. 브라질 O. camponoti-rufipedis를 배양하는 데 어려움을 겪으면서 초안 게놈을 얻는 데 필요한 DNA 판독 외에 RNA-Seq 데이터를 생성하기에 충분한 재료를 얻지 못했습니다. O. kimflemingiae와 O. camponoti-rufipedis는 모두 동일한 종 복합체 (unilateralis) 내에 존재하기 때문에, 우리는 주석을 알리는 데 사용할 수 있는지 확인하기 위해 북미 일방적 종 읽기를 O. camponoti-rufipedis 게놈에 매핑하려고 시도했습니다. 그러나 O. kimflemingiae의 93 %가 자체 게놈에 매핑 된 반면, 43 %만이 O. camponoti-rufipedis 게놈에 매핑되었습니다 (보충 표 S2). 우리는 또한 다른 출판 된 O. unilateralis s.l. O. polyrhachis-furcata 22의 게놈을 사용하여 이것이보다 일반적인 교차 매핑 효과인지 O. camponoti-rufipedis 게놈에 특이 적인지 여부를 결정합니다. 41 %의 유사한 매핑 결과가 나왔습니다. 이것은 unilateralis 종이 일반적으로 다소 먼 관련이있을 수 있으므로 주석을 알리는 교차 매핑이 덜 적합 할 수 있음을 시사합니다. 정보 제공을 위해 우리는 또한 오스트 랄리스 종을 서로 교차 매핑했습니다 (브라질의 MAP-64 균주와 가나의 1348a 균주). 이로 인해 71 % 및 82 % 교차 매핑 된 읽기가 각각 86 % 및 97 %가 자체 게놈에 매핑되었습니다 (보충 표 S2). 이것은 오스트 랄리스 복합체의 종들이 일방적 복합체 내의 종보다 서로 훨씬 더 밀접하게 관련되어 있음을 의미합니다.

직교성 클러스터

우리는 어떤 유전자 예측을 조사하기 시작했습니다. 이 연구에서 개미를 감염시키는 Ophiocordyceps 종은 보존되고 다른 자낭 균과 공유 될 가능성이 높습니다. 또한, 우리는 어떤 종 특이 적 및 “조작 특이 적”전문화가 발생했을 수 있는지 알아 보는 것을 목표로했습니다. 5 개 개미 감염 진균의 예측 된 단백질을 18 개의 다른 자낭 균 진균과 비교했습니다.이 종 중 10 종은 동물 기생충 (2 마리의 감염 포유류, 2 마리의 감염 선충류, 6 마리의 감염 곤충)이었고 13 종은 같은 순서 (Hypocreales)에 속했습니다 .4 종은 같은과 (Ophiocordycipitaceae)에 속하고 2 종은 같은 속 (Ophiocordyceps)에 속했습니다. 이러한 각 유기체에 존재하는 67 개의 보존 된 유전자를 기반으로 한 계통 발생 재구성은 그림 2에 나와 있습니다.

총 51,012 개의 orthologous 클러스터에 주석이 달린 모든 단백질이 포함되었습니다. 이 분석에 포함 된 23 개의 자낭 균 각각의 (보충 데이터 S1). 이 클러스터링에 관한 요약 통계는 보충 그림 S1에서 찾을 수 있습니다. 우리는 세 가지 종 범위 사이의 orthologous 클러스터의 겹침을 비교했습니다. , 및 3) 다른 동물 감염, 식물 감염, 곰팡이 감염 및 부양 균을 포함하는 모든 비-곤충 감염 자낭 균. 이 분석의 결과는 그림 3a의 벤 다이어그램에 묘사되어 있습니다. 그 후, 우리는 다이어그램의 다양한 겹침 및 겹치지 않는 부분 내에서 발견 된 개미 감염 종 유전자의 기능적 주석에 대한 농축 분석을 수행했습니다. 세 가지 종 범위 모두에서 발견 된 7,931 개의 orthologous 클러스터 중에서 일반적인 생물학적 과정에 대한 유전자 온톨로지 (GO) 주석이 상당히 과도하게 표현되었습니다. 이것은 예상대로 생활 방식이 다른 자낭 균이 전사, 번역, 단백질 수송 및 신호 전달과 같은 일반적인 과정에 유사한 메커니즘을 사용함을 시사합니다. 그러나 (작은) 분비 단백질, 다중 유기체 과정 및 병인에 대한 GO 주석이있는 단백질,보다 구체적으로 분비 된 추정 장 독소를 암호화하는 것으로 예측 된 유전자는 과소 표현되었습니다. 실제로 개미 감염 종 (즉, 6,672 개 군집, 그림 3a)에서만 발견 된 직교 군집에 존재하는 주석의 농축 분석을 수행했을 때 반대 결과를 발견했습니다. (대부분 동일한) 일반적인 생물학적 과정에 대한 GO 주석은 현저하게 과소 표현 된 반면, (작은) 분비 단백질, 다중 유기체 과정 및 병인에 대한 GO 주석이있는 단백질, 추정 장 독소가 과다 표현되었습니다. 이것은이 연구에서 개미를 감염시키는 진균의 secretome의 상당 부분이 그들에게 특이하다는 것을 시사합니다. 이 특이성은 부분적으로 시크릿 톰의 일부인 장 독소와 곰팡이-개미 상호 작용에서 중요 할 수있는 생체 활성 소 분비 단백질 (SSP)로 인해 나타났습니다. (작은) 분비 된 단백질은 또한 개미 감염 진균이 다른 곤충 병원체 (262 개 클러스터) 또는 비엔 토모 병원체 (449 개 클러스터)와 배타적으로 공유하는 클러스터 사이에서 과도하게 나타납니다. 이것은 그들의 secretome이 더 일반적인 entomopathogen-specific 단백질뿐만 아니라 non-entomopathogenic ascomycetes와 독점적으로 공유되는 단백질을 포함하고 있음을 나타냅니다.

우리는 또한 개미를 감염시키는 진균 중에서 만 발견되는 이종 군집이 그 종에 의해 어떻게 나타나는지 조사했습니다 (그림 3b). 이 비교에서 총 6,672 개의 군집 중 90.6 %가 특정 종으로 나타났습니다. 따라서이 연구의 모든 종이 같은 속 (Ophiocordyceps)에 있고 어떤 경우에는 동일한 종 복합체 (O. unilateralis s.l. 및 O. australis s.l.) 내에 있음에도 불구하고 군집 중첩은 한계가있었습니다. 이러한 종 특이 적 클러스터에서 기능적 주석 용어의 농축을 분석하면 다시 (작은) 분비 단백질이 과도하게 표현되었습니다. 한계 적이지만 대부분의 군집 겹침은 동일한 복합체 내에서 더 밀접하게 관련된 종들 사이에서 발견되었습니다 (예 : O. australis s.l., 289 개 군집, O. unilateralis s.l., 182 군집 그림 3b). 또한 여기에서 농축 분석 결과 (작은) 분비 단백질에 대한 과잉 표현이 밝혀졌습니다. 따라서, 이러한 개미 감염 종의 진균 분비물의 통계적으로 유의미한 양은 복합 또는 종 특이적인 것으로 보입니다. 또한 복잡한 특정 orthologous 클러스터 사이에서 병원성 GO 용어의 과다 표현을 발견했습니다. 이 발견은 동일한 복합체 내의 종에 이종성 장 독소가 존재하기 때문일 수 있습니다.우리의 비교에서 다른 자낭 균에는 존재하지 않았던 4 개의 군집 만이 5 개 개미 감염 종 모두에서 공유되었습니다 (그림 3b). 이 4 개의 클러스터 중 어느 것도 기능적 주석을받지 못했지만 그중 3 개에는 분비 신호가 예측 된 유전자가 포함되어있었습니다. 4 개 클러스터 중 3 개에 대해 NCBI 데이터베이스에 대한 유전자의 BLASTp 분석은 O. kimflemingiae 게놈의 이전에 기탁 된 버전으로 가설적인 단백질 히트 만 발생했습니다. 이것은 이러한 클러스터가 실제로 개미 감염 Ophiocordyceps 종에 고유 한 단백질을 나타낼 수 있음을 나타냅니다. 네 번째 클러스터 내의 단백질 서열은 O. kimflemingiae (XA68_3159), (보충 표 S3)의 가상 단백질과 다시 정렬하는 것 외에도 메탈로 프로테아제에 대한 히트를 초래했습니다. 따라서이 클러스터에는 여기에서 조사 된 개미 감염 곰팡이 종의 게놈에서만 발견되는 추정 메탈로 프로테아제가 포함될 수 있습니다. 더욱이 개미를 감염시키는 균류에서 유일하게 발견 된 클러스터 중 2 개만이 물기 행동을 유도하는 네 종 모두에서 공유되었습니다 (그림 3b). 이러한 클러스터 내의 유전자에 대한 BLASTp 분석은 이전에 기탁 된 O. kimflemingiae 게놈 18 (보충 표 S4)과 함께 가상의 단백질 히트를 다시 발생 시켰습니다 (보충 표 S4).

물린 행동을 설정하는 데 관여하는 후보 조작 유전자

감염된 개미에서 관찰 된 조작 된 물림 사건과 관련된 후보 유전자의 보존을 분석했습니다. 우리는 이전에 발표 된 transcriptomics 데이터 18를 사용하고 데이터를 O. kimflemingiae 게놈의 새 버전에 매핑하여 차동 유전자 발현을 다시 결정했습니다. 이전에 발표 된 연구에 따르면, 우리는 조작 된 물기 행동을 확립하는 데 관여하는 후보 유전자가이 이벤트 동안 상향 조절되고 이후에 다시 빠르게 하향 조절 될 것이라는 추론을 따랐습니다. 따라서 547 개의 후보 유전자가 확인되었으며 이는 이전 분석에서보고 된 것보다 49 개 더 많습니다 18. 이전에보고 된 데이터에 따라 DNA 복제, 산화-환원 과정, 분비 및 이차 대사와 관련된 유전자가 과도하게 표시되었습니다.

후보 조작 유전자의 보존도 orthologous clustering을 통해 분석되었습니다. 우리는 O. kimflemingiae에서 물기 행동을 조작 한 후 크게 상향 및 하향 조절 된 후보 유전자를 포함하는 orthologous 클러스터의 중첩을 세 가지 종 범위와 비교했습니다. 1) 4 개의 새로운 초안을 구성하는 다른 개미 감염 진균 이 연구에서 생성 된 게놈, 2) 다른 곤충 감염 진균, 3) 이전에 비교를 위해 사용 된 모든 비-곤충 감염 자낭 균. 이 분석의 결과는 그림 4의 Venn Diagram에 묘사되어 있습니다. 후보 조작 유전자 중 78 %는 다른 모든 세 종 범위 (즉, 423 클러스터, 그림 4)에 존재하는 유전자의 orthologs 인 것으로 나타났습니다. 이것은 O. kimflemingiae에 의해 유도 된 조작 된 물기 동안 발현 된 유전자가 조작에 특이 적이 지 않다는 것을 의미한다. 이러한 광범위하게 공유되는 유전자 중 CYP 및 기타 산화-환원 관련 기능은 과도하게 표현되었으며 분비 된 단백질과 프로테아제를 인코딩하는 유전자도 있습니다. 다양한 이차 대사 주석 (클러스터 7,8 및 9)도 이러한보다 광범위하게 공유되는 이종성 클러스터 사이에서 과도하게 표현되었습니다. 그들은 맥각 알칼로이드 합성에 관여하는 트립토판 디메틸 알릴 트랜스퍼 라제, 다양한 사이토 크롬, 작은 분비 단백질, 폴리 케 타이드 합성 효소 (PKS) 및 PKS-NRPS (비-리보솜 단백질 합성 효소) 하이브리드로 구성되었습니다. O. kimflemingiae에 고유 한 것으로 보이는 후보 조작 유전자 (즉, 59 개 클러스터, 그림 4) 중 SSP 만 과도하게 표현되었습니다. 그러나 이러한 “고유 한”유전자의 92 %는 기능적 주석을받지 못했습니다. 세 가지 종 범위와 겹치는 부분이 발견 된 경우 SSP는 더 큰 분비 단백질과 마찬가지로 과도하게 나타납니다. 개미 감염에만 존재하는 유전자 중 균류 (즉, 24 개의 클러스터 그림 4), 다시 대다수 (79 %)는 기능적 주석을받지 못했습니다. 모든 곤충 감염 종에 존재하지만 다른 자낭 균에는 존재하지 않는 7 개의 orthologous 클러스터 중에서 추정치를 발견했습니다. 이 장 독소는 물기 행동을 유발하는 종인 O. kimflemingiae (2 개의 orthologs), O. camponoti-rufipedis (1 개의 ortholog), O. subramanianii sl (2 개의 orthologs) 및 O. australis-Ghana (2 개의 orthologs)에 존재했습니다. , O. australis-Brazil 및 O. sinensis에서도 마찬가지입니다. 또한 O. kimflemingiae의 두 장 독소 ortholog 중 하나는 > 3,000 배로 극적인 표현 패턴을 보여주었습니다. -조작 중 규제 및 이후 200 배 하향 규제 18. 따라서이 장 독소는 Ophiocordyceps 종에 의한 행동 조작의 확립에 잠재적으로 중요한 핵심 역할을 할 수 있습니다.

2 차 대사 산물 클러스터의 보존

일반적인 가설은 더 큰 생물 활성 화합물과 함께 2 차 대사 산물의 분비를 통해 숙주 행동이 변경된다는 것입니다. . 이 가설은 조작 된 물기 행동 중에 상향 조절되는 O. kimflemingiae의 유전자 중 특정 주석이 달린 이차 대사 산물 클러스터의 과다 표현에 의해 뒷받침됩니다. 이를 더 자세히 살펴보면 실제로 주석이 달린 이차 대사 산물 클러스터 내부에있는 유전자가이 특정 발현 패턴을 따른다는 것을 발견했습니다 (그림 5a). 우리는이 클러스터가 곤충을 감염시키는 Ophiocordyceps 균류 중에서 보존되어 있는지 물었습니다. 이것은 관찰 된 조작 된 행동을 확립하기 위해 개미 숙주와 상호 작용하기 위해이 진균에 의한 2 차 대사 산물의 사용에있어서 유사성을 암시 할 것이다. 따라서 우리는 O. kimflemingiae의 주석이 달린 클러스터 7,8 및 9와 그 직접 측면 유전자를 조사했습니다. 이 클러스터는 1) 조작 된 물기 행동 동안 상향 조절 된 후 상당한 하향 조절이 뒤따 랐으며, 2) 다른 자낭 균과 공유 된 orthologs (위 참조). 이 클러스터 내의 유전자에 대해, 우리는 다른 4 개의 개미 감염 진균에서 상 동체 (BLASTp 정렬) 및 오르 솔로 그 (orthologous 클러스터링)를 검색했습니다 (그림 5b 및 보충 그림 S3). 이것은 unilateralis 종이 대체로 유사한 클러스터에서 2 차 대사 관련 유전자의 적어도 일부를 조직했다는 것을 입증했습니다. 다른 Ophiocordyceps 종은 게놈 전체에 흩어져있는 이러한 2 차 대사 유전자의 상 동체 및 이종 상 동체를 가졌거나 전혀 사본을 포함하지 않았습니다 (그림 5b 및 보충 그림 S3). 예를 들어 O. kimflemingiae의 주석이 달린 클러스터 8에는 산화-환원 관련 CYP와 FAD 결합 도메인이있는 유전자가 측면에있는 트립토판 디메틸 알릴 트랜스퍼 라 제가 포함되어 있습니다. 이 클러스터는 유사한 발현 패턴을 따르는 7 개의 유전자가 바로 옆에 있습니다 (그림 5a). O. camponoti-rufipedis 게놈은 유사한 방식으로이 트립토판 디메틸 알릴 트랜스퍼 라제를 가졌다; CYP와 FAD- 결합 유전자가 옆에 있고, 그 다음에는 인접 유전자의 상 동체와 이종상 동체가 뒤 따른다 (그림 5b). O. subramanianii s.l. 게놈은 또한 유사한 트립토판 디메틸 알릴 트랜스퍼 라제를 가졌다. 그러나 그것은 비 상동 / 직교 CYP 및 FAD 결합 유전자가 측면에있었습니다. 사실, O. subramanianii s.l. 이 유전자의 상 동체 / 오톨 로그를 가지고 있었지만 주석이 달린 2 차 대사 산물 클러스터 바로 외부의 유전자처럼 완전히 다른 콘티 그에 상주했습니다 (그림 5b). 더욱이, 두 오스트 랄리스 종은이 특정 트립토판 디메틸 알릴 트랜스퍼 라제를 암호화하는 이종 / 상동 유전자를 갖지 않았습니다. 사실, 가나의 오스트 랄리스 종은 추정되는 트립토판 디메틸 알릴 트랜스퍼 라제를 전혀 포함하지 않는 것으로 나타났습니다. 다른 2 차 대사 산물 클러스터를 분석하여 유사한 결론을 내릴 수 있습니다 (보충 그림 S3). O. kimflemingiae의 클러스터 7과 9는 각각 O. camponoti-rufipedis의 클러스터 31과 8과 거의 비슷해 보였다. 그러나 이러한 클러스터와 관련된 유전자는 다시 세 개의 다른 개미 감염 종의 게놈에 존재하지 않거나 흩어져 있습니다.

진균 장 독소의 계통

주석이 달린 장 독소 PFAM 도메인 (PF01375)과 분비 신호를 포함하는 유전자는 추정되는 분비 장 독소로 표시되었습니다. 이전 결과와 우리의 현재 연구는 이러한 추정 장 독소를 암호화하는 유전자가 Ophiocordyceps 곰팡이의 행동 조작 종에서 중요하다는 것을 암시합니다.분비 된 박테리아와 유사한 독소는 숙주에서 화학 신호 분자의 생성을 방해함으로써 개미 행동에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 boll weevils23,24의 성 페로몬에서 박테리아 entomopathogens의 장 독소에 대해 입증되었습니다. 그러나 그들은 단순히 화합물을 죽이는 기능을 할 수 있습니다 25. 또한 이러한 추정되는 장 독소 중 하나는 조작 된 물기 사건에서만 극도로 고도로 상향 조절되었습니다 18. 이 특정 유전자는이 연구에서 O. australis-Brazil 및 O. sinensis뿐만 아니라 모든 개미 조작 Ophiocordyceps 종에 존재했습니다. 더욱이, 개미 감염 진균은 이러한 병원성 관련 단백질을 암호화하는 유전자가 상당히 많은 것으로 나타났습니다. 다른 자낭 균은 일반적으로 훨씬 적은 수 (즉, 다른 곤충 병원균, 선충 감염 진균 및 Magnaporthe oryzae) 또는 장 독소 도메인 함유 유전자 (즉,이 연구에서 나머지 자낭 균)를 포함하지 않았습니다. 개미를 감염시키는 Ophiocordyceps 종의 게놈은 20 ~ 36 개의 추정 장 독소를 가지고 있었고 O. australis-Ghana (n = 20)가 가장 작고 O. kimflemingiae (n = 36)가 가장 많았습니다. 선충 감염 진균 Ophiocordyceps minnesotensis와 Drechmeria coniospora는 장 독소 PFAM 도메인을 가진 19 개와 25 개의 유전자를 포함했습니다. Hypocreales 목의 다른 곤충 병원체는 Metarhizium robertsii와 Cordyceps bassiana가 가장 많은 (각각 n = 16 및 n = 14) 4-16 개의 장 독소 주석만을 포함했습니다. 이 연구에서 다른 자낭 균 게놈은 6 개가 포함 된 식물 병원균 M. oryzae를 제외하고는 장 독소를 코딩하는 유전자가 없었습니다.

우리는이 연구에서 모든 곰팡이 유전자를 기반으로 계통 발생 수를 구축했습니다. PF01375 열에 불안정한 장 독소 알파 사슬 도메인을 포함했습니다. 장 독소는 대부분 박테리아 종에 대해보고되었습니다 (예 : refs 23,24,25). 따라서 우리는 또한 네 가지 박테리아 장 독소를 포함했습니다. 그 결과 252 개의 도메인 영역을 기반으로 한 트리가 생성되었습니다. 우리는 먼저 박테리아 및 식물 감염 종 (즉, M. oryzae)의 장 독소가 대부분의 동물 감염 종 (즉, 곤충 및 선충 감염 균류)과 관련하여 어떻게 클러스터되는지를 결정했습니다. 이것은 세 개의 박테리아 장 독소를 하나의 클레이 드에 배치하고 네 번째는 별도의 클레이 드에 배치했습니다 (보조 그림 S4). Leptospira mayottensis에서 추출한 세균성 장 독소는 식물을 감염시키는 M. oryzae clade의 외곽 집단을 형성했습니다. M. oryzae는 Hypocreales 주문 외부에 있습니다. 따라서,이 종의 식물 병원성 장 독소는 외부 그룹으로 사용되었으며 나무는 L. mayottensis에 뿌리를두고 있습니다 (보충 그림 S4). 이 나무는 개미 감염 진균의 일부 장 독소가 다른 곤충 또는 선충 감염 종의 장 독소와 관련이 있음을 보여줍니다. 다른 장 독소는 자체 클레이 드를 형성했습니다. 이러한 개미 감염 특이적인 클레이 드 내에서 두 개의 일 방성 복합 종 또는 오스트 랄리스 복합 종의 장 독소가 종종 쌍을 이룹니다. Ophiocordyceps subramanianii s.l. 장 독소는 종종 일방적 또는 오스트 랄리스 특정 클레이 드로 외집단을 형성했습니다 (보충 그림 S4). 또한,이 연구에서 모든 개미 감염 종 (및 O. sinensis, 위 참조) 사이에서 보존되었을뿐만 아니라 조작 된 교합 행동 (예 : GeneID Ophio5 | 373 보충 그림 S4) 동안 고도로 상향 조절 된 장 독소가 존재했습니다. 개미를 조종하는 종만 포함 된 클레이 드 안에서. 이것은이 특정 장 독소가이 연구에 포함 된 종에서 관찰 된대로 조작 된 행동을 확립하는 데 정말로 중요 할 수 있음을 나타냅니다.