抗感染性オフィオコルディケプスゲノムは、潜在的な行動操作遺伝子の多様性とエンテロトキシンの主要な役割の可能性を明らかにしています

ゲノムの特徴

この研究で生成されたオフィオコルディケプスドラフトゲノム（表1）は、2種類のDNAライブラリーを使用してさまざまなシーケンス実行で生成されたリードで組み立てられました。高品質の読み取りにつながる実行のみがアセンブリに使用されました（材料と方法を参照）。コンティグアセンブリにより、O。unilateraliss.lのゲノムサイズは2,191〜2,392万塩基対（Mbp）の範囲になりました。およびO.australis s.l.種。対照的に、O。subramanianiis.l.推定ゲノムサイズは32.31Mbでした。遺伝子予測により、O.unilateralisおよびO.australis種の7,621〜8,629個の遺伝子が得られました。 Ophiocordyceps subramanianii s.l. 11,275個の遺伝子があると予測されました。さらに、O。subramanianiis.l. （すなわち60.35％）は、この研究の他のOphiocordyceps種（54.66％+ /-1.57％）と比較してはるかに高かった（表1）。

また、以前に公開されたOのゲノムのアセンブリと遺伝子予測を改善しました。片側性sl現在、種名O. kimflemingiae 20を取得しているSC16a株（補足表S1）。断片化が少ないことに加えて、新しいアセンブリは以前に報告されたものよりも小さくなっています18。これは、この研究の他のアリ感染種と比較して、片側性種（6.59〜6.83％）で最も高いことがわかった反復領域のより良い集合による可能性が最も高いです（表1）。アセンブリサイズが小さいにもかかわらず、新しい遺伝子予測により、798個の遺伝子で遺伝子数が増加しました。この増加は主に、Braker1パイプラインを使用したキメラ（つまり、1つの遺伝子モデルに誤ってマージされた隣接遺伝子）の予測が少ないために発生します（データは表示されていません）。

1つを除くすべてのゲノムで生成されたこの研究では、遺伝子予測はRNA-Seqリードによって通知されました。以前に報告された北米のタイワンアリタケ種O.kimflemingiaeについては、その以前の研究で生成された読み取りが使用されました18。ブラジルのO.camponoti-rufipedisの培養が困難であったため、ドラフトゲノムを取得するために必要なDNA読み取りに加えて、RNA-Seqデータを生成するのに十分な材料が得られませんでした。 O.kimflemingiaeとO.camponoti-rufipedisの両方が同じ複合種（unilateralis）内に存在するため、北米のunilateralis種の読み取りをO. camponoti-rufipedisゲノムにマッピングして、注釈を通知するために使用できるかどうかを確認しました。ただし、O。kimflemingiaeの読み取りの93％が独自のゲノムにマッピングされているのに対し、O。camponoti-rufipedisのゲノムにマッピングされているのは43％のみです（補足表S2）。さらに、読み取りを別の公開されたO. unilateraliss.lにマッピングしました。これがより一般的なクロスマッピング効果であるか、またはO. camponoti-rufipedisゲノムに特異的であるかを決定するための、O。polyrhachis-furcata22のゲノム。 41％の同様のマッピングが得られました。これは、片側性の種が一般的にかなり遠い関係にあり、注釈を通知するためのクロスマッピングをあまり適切にしない可能性があることを示唆しています。有益な目的のために、我々はまた、オーストラリス種を互いにクロスマッピングしました（ブラジルからのMAP-64株とガーナからの1348a株）。これにより、71％と82％のクロスマップ読み取りが行われたのに対し、86％と97％はそれぞれ独自のゲノムにマップされました（補足表S2）。これは、したがって、子嚢菌複合体の種は、片側子嚢菌複合体内の種よりもはるかに密接に関連している可能性が高いことを意味します。

オーソロガスクラスター

この研究におけるアリに感染するOphiocordyceps種は保存されており、他の子嚢菌と共有されている可能性があります。さらに、どの種固有および「操作固有」の特殊化が行われた可能性があるかを発見することを目的としました。そのため、5つのアリ感染真菌の予測プロテオームを、他の18の子嚢菌のプロテオームと比較しました。これらの種のうち10動物寄生虫（2匹の感染哺乳類、2匹の感染線虫、6匹の感染昆虫）であり、13種は同じ順序で生息し（Hypocreales）、4種は同じ家族に属し（Ophiocordycipitaceae）、2種は同じ属に属していた（Ophiocordyceps）。これらの各生物に存在する67の保存された遺伝子に基づく系統学的再構築を図2に示します。

合計51,012個のオーソロガスクラスターにすべての注釈付きタンパク質が含まれていましたこの分析に含まれる23の子嚢菌のそれぞれの（補足データS1）。このクラスタリングに関する要約統計量は、補足図S1にあります。 3つの種の範囲間でオーソロガスクラスターの重複を比較しました：1）この研究で生成された5つのドラフトゲノムすべてを含む子嚢菌、2）他の昆虫感染菌Ophiocordyceps sinensis、Tolypocladium inflatum、両方のMetarhiziumおよび両方のCordyceps種、および3）他の動物感染性、植物感染性、真菌感染性、および腐敗性真菌を含む、すべての非昆虫感染性子嚢菌。この分析の結果は、図3aのベン図に示されています。続いて、図のさまざまな重複部分と非重複部分で見つかったアリ感染種遺伝子の機能アノテーションの濃縮分析を実行しました。 3つの種の範囲すべてで見つかった7,931のオーソロガスクラスターのうち、一般的な生物学的プロセスの遺伝子オントロジー（GO）注釈が大幅に過大評価されていました。これは、予想通り、ライフスタイルの異なる子嚢菌が、転写、翻訳、タンパク質輸送、シグナル伝達などの一般的なプロセスに同様のメカニズムを使用していることを示唆しています。ただし、（小さな）分泌タンパク質、多生物プロセスおよび病因のGOアノテーションが付いたタンパク質、より具体的には、分泌された推定エンテロトキシンをコードすると予測される遺伝子は過小評価されていました。実際、アリに感染する種にのみ見られるオーソロガスクラスター（つまり、6,672クラスター、図3a）に存在する注釈の濃縮分析を実行すると、反対の結果が見つかりました。 （ほぼ同じ）一般的な生物学的プロセスのGOアノテーションは大幅に過小評価されていましたが、（小さな）分泌タンパク質、多生物プロセスと病因のGOアノテーションが付いたタンパク質、および推定エンテロトキシンは過大評価されていました。これは、この研究におけるアリ感染真菌のセクレトームの重要な部分がそれらに特異的であることを示唆している。この特異性は、セクレトームの一部であるエンテロトキシンと、真菌とアリの相互作用に重要である可能性のある生物活性のある小さな分泌タンパク質（SSP）が原因の一部でした。 （小さな）分泌タンパク質はまた、アリ感染真菌が他の昆虫病原体（262クラスター）または非昆虫病原体（449クラスター）のいずれかと排他的に共有するクラスター間で過剰に表されました。これは、それらのセクレトームが、より一般的な昆虫病原糸状菌特異的タンパク質、および非昆虫病原性子嚢菌と排他的に共有されるタンパク質も含むことを示しています。

また、アリに感染する真菌にのみ見られるオーソロガスクラスターがこれらの種によってどのように表されるかを調べました（図3b）。この比較における合計6,672のクラスターのうち、90.6％が種特異的であるように見えました。したがって、この研究のすべての種が同じ属（Ophiocordyceps）内にあり、場合によっては同じ種の複合体（O. unilateraliss.l。およびO.australis s.l.）内にある場合でも、クラスターの重複はわずかでした。これらの種特異的クラスターにおける機能アノテーション用語の濃縮を分析すると、（小さな）分泌タンパク質の過剰発現が再び生じました。わずかではありますが、ほとんどのクラスターの重複は、同じ複合体内のより密接に関連する種の間で見つかりました（つまり、O。australiss.l.、289クラスター、およびO. unilateralis s.l.、182クラスター図3b）。ここでも、濃縮分析により、（小さな）分泌タンパク質の過剰発現が明らかになりました。したがって、これらのアリに感染する種の真菌セクレトームの統計的に有意な量は、複合体または種に特異的であるように思われる。さらに、複合体固有のオーソロガスクラスターの中で病原性GO用語の過剰表現が見つかりました。この発見は、同じ複合体内の種におけるオーソロガスエンテロトキシンの存在に起因する可能性があります。私たちの比較では他の子嚢菌のいずれにも存在しなかった4つのクラスターだけが、5つのアリ感染種すべての間で共有されました（図3b）。これらの4つのクラスターはいずれも機能アノテーションを受け取りませんでしたが、そのうちの3つには分泌シグナルが予測される遺伝子が含まれていました。 4つのクラスターのうち3つについて、NCBIデータベースに対する遺伝子のBLASTp分析は、以前に寄託されたバージョンのO.kimflemingiaeゲノムでの仮想的なタンパク質ヒットのみをもたらしました18。これは、これらのクラスターが実際にアリに感染するオフィオコルディケプス種に固有のタンパク質を表している可能性があることを示しています。 4番目のクラスター内のタンパク質配列は、O。kimflemingiae（XA68_3159）からの仮想タンパク質と再び整列することに加えて、メタロプロテアーゼによるヒットをもたらしました（補足表S3）。したがって、このクラスターには、ここで調べたアリに感染する真菌種のゲノムにのみ見られる推定メタロプロテアーゼが含まれている可能性があります。さらに、アリに感染する真菌で独自に発見されたクラスターのうち、噛む行動を誘発する4つの種すべてで共有されたのは2つだけでした（図3b）。これらのクラスター内の遺伝子のBLASTp分析により、以前に寄託されたバージョンのO. kimflemingiaeゲノム18（補足表S4）で仮想的なタンパク質ヒットが再び生じました。

噛む行動の確立に関与する候補操作遺伝子

感染したアリで観察された操作された噛みつきイベントに関連する候補遺伝子の保存を分析しました。以前に公開されたトランスクリプトミクスデータ18を使用し、データをO.kimflemingiaeゲノムの新しいバージョンにマッピングすることによって遺伝子発現の差異を再決定しました。以前に発表された研究によると、操作された噛みつき行動の確立に関与する候補遺伝子は、このイベント中にアップレギュレートされ、その後すぐに再びダウンレギュレートされるという推論に従いました。そのため、547個の候補遺伝子が同定されました。これは以前の分析で報告されたものより49個多い18。以前に報告されたデータと一致して、DNA複製、酸化還元プロセス、分泌、および二次代謝に関与する遺伝子が過剰に表されました。

候補操作遺伝子の保存も、オーソロガスクラスタリングによって分析されました。 O. kimflemingiaeの噛みつき行動を操作した後、有意にアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた候補遺伝子を含むオーソロガスクラスターの重複を3つの種の範囲と比較しました：1）4つの新しいドラフトを構成する他のアリ感染真菌この研究で生成されたゲノム、2）他の昆虫に感染する真菌、および3）以前に比較のために使用されたすべての非昆虫に感染する子嚢菌。この分析の結果は、図4のベン図に示されています。候補操作遺伝子のうち、78％は、他の3つの種の範囲すべてに存在する遺伝子のオルソログであるように見えました（つまり、423クラスター、図4）。これは、O。kimflemingiaeによって誘発された操作された噛みつきの間に発現された遺伝子が操作に特異的ではない可能性が高いことを意味します。これらの広く共有されている遺伝子の中で、CYPおよびその他の酸化還元関連機能、ならびに分泌タンパク質およびプロテアーゼをコードする遺伝子が過剰に表されていました。さまざまな二次代謝アノテーション（クラスター7、8、および9）も、これらのより広く共有されているオーソロガスクラスター間で過剰に表現されていました。それらは、エルゴットアルカロイド合成に関与するトリプトファンジメチルアリルトランスフェラーゼ、さまざまなシトクロム、小さな分泌タンパク質、ポリケチドシンターゼ（PKS）、およびPKS-NRPS（非リボソームタンパク質シンテターゼ）ハイブリッドを含んでいた。 O. kimflemingiaeに固有であると思われる候補操作遺伝子（すなわち、59クラスター、図4）の中で、SSPのみが過剰に表されていました。ただし、これらの「固有の」遺伝子の92％は、機能アノテーションを受け取りませんでした。3つの種の範囲と他の重複が見つかった場合、より大きな分泌タンパク質と同様に、SSPも過剰に表されました。アリ感染にのみ存在するもののうち真菌（すなわち、24クラスター図4）も、大多数（79％）が機能アノテーションを受け取りませんでした。すべての昆虫感染種に存在したが、他のアリには存在しなかった7つのオーソロガスクラスターの中で、推定上の、分泌されたエンテロトキシンこのエンテロトキシンは、噛む行動を誘発する種O. kimflemingiae（2つのオルソログ）、O。camponoti-rufipedis（1つのオルソログ）、O。subramanianiisl（2つのオルソログ）、およびO. australis-Ghana（2つのオルソログ）に存在しました。 、およびO.australis-ブラジルとO.sinensis。さらに、O。kimflemingiaeの2つのエンテロトキシンオルソログの1つは、> 3,000倍の劇的な発現パターンを示しました。 -操作中のレギュレーションとその後の200倍のダウンレギュレーション18。したがって、このエンテロトキシンは、これらのオフィオコルディケプス種による行動操作の確立において重要な重要な役割を果たしている可能性があります。

二次代謝産物クラスターの保存

一般的な仮説は、より大きな生物活性化合物に加えて、二次代謝産物の分泌によって宿主の行動の変化が確立されるというものです。 。この仮説は、操作された噛みつき行動中にアップレギュレートされるO.kimflemingiaeの遺伝子間の特定の注釈付き二次代謝産物クラスターの過剰表現によって裏付けられています18。これらをさらに詳しく調べると、実際に、注釈付きの二次代謝産物クラスター内にあるが直接隣接している遺伝子が、この特定の発現パターンに従っていることがわかりました（図5a）。これらのクラスターが昆虫に感染するオフィオコルディケプス菌の間で保存されているかどうかを尋ねました。これは、観察された操作された行動を確立するためにそれらのアリの宿主と相互作用するためにこれらの真菌による二次代謝産物の使用における類似性を示唆するであろう。そのため、O。kimflemingiaeの注釈付きクラスター7、8、および9とそれらの直接隣接遺伝子を調べました。これらのクラスターは、1）操作された噛みつき行動中にアップレギュレートされ、その後に有意なダウンレギュレーションが続き、2）他の子嚢菌とオルソログを共有しました（上記を参照）。これらのクラスター内の遺伝子について、他の4つのアリ感染真菌のホモログ（BLASTpアラインメント）とオルソログ（オーソログクラスタリング）を検索しました（図5bおよび補足図S3）。これは、片側性種がそれらの二次代謝関連遺伝子の少なくともいくつかをほぼ同様のクラスターに組織化したことを示した。他のオフィオコルディケプス種は、これらの二次代謝遺伝子のホモログとオルソログがゲノム全体に散在しているか、コピーをまったく含んでいませんでした（図5bおよび補足図S3）。たとえば、O。kimflemingiaeの注釈付きクラスター8には、酸化還元関連CYPとFAD結合ドメインを持つ遺伝子が隣接するトリプトファンジメチルアリルトランスフェラーゼが含まれていました。このクラスターは、同様の発現パターンに従った7つの遺伝子に直接隣接しています（図5a）。 O. camponoti-rufipedisゲノムには、同様の方法でこのトリプトファンジメチルアリルトランスフェラーゼがありました。 CYPとFAD結合遺伝子が隣接し、その後に隣接遺伝子のホモログとオルソログが続きます（図5b）。 O. subramanianii s.l.ゲノムにも同様のトリプトファンジメチルアリルトランスフェラーゼがありました。しかしながら、それは非相同/オーソロガスCYPおよびFAD結合遺伝子に隣接していました。実際、O。subramanianiis.l.これらの遺伝子のホモログ/オルソログはありましたが、注釈付きの二次代謝産物クラスターのすぐ外側の遺伝子と同様に、完全に異なるコンティグに存在していました（図5b）。さらに、両方のオーストラリス種は、この特定のトリプトファンジメチルアリルトランスフェラーゼをコードするオーソロガス/ホモログ遺伝子を持っていませんでした。実際、ガーナのオーストラリス種には、推定上のトリプトファンジメチルアリルトランスフェラーゼがまったく含まれていないようでした。他の二次代謝産物クラスターを分析しても、同様の結論を下すことができます（補足図S3）。 O. kimflemingiaeのクラスター7と9は、それぞれO.camponoti-rufipedisのクラスター31と8にほぼ匹敵するようでした。それでも、これらのクラスターに関連する遺伝子は、他の3つのアリ感染種のゲノム全体に存在しないか散在していました。

真菌エンテロトキシンの系統

注釈付きエンテロトキシンPFAMドメイン（PF01375）と分泌シグナルを含む遺伝子は、推定上の分泌型エンテロトキシンとして示されました。以前の結果と私たちの現在の研究は、これらの推定エンテロトキシンをコードする遺伝子がオフィオコルディケプス菌の行動操作種において重要であることを示唆しています。これらの分泌された細菌様毒素は、宿主における化学療法シグナル伝達分子の産生を妨害することにより、アリの行動に影響を与える可能性があります。これは、ボールウィービルの性フェロモン中の細菌性昆虫病原体からのエンテロトキシンについて実証されました23,24。しかし、それらは単なる殺害化合物としても機能する可能性があります25。さらに、これらの推定エンテロトキシンの1つは、操作された噛み付きイベント中にのみ非常に高度にアップレギュレートされました18。この特定の遺伝子は、この研究のすべてのアリを操作するOphiocordyceps種、およびO.australis-BrazilとO.sinensisに存在していました。さらに、アリに感染する真菌は、これらの病原性関連タンパク質をコードするかなり多数の遺伝子を持っているように見えた。他の子嚢菌は一般に、はるかに少ない（すなわち、他の昆虫病原菌、線虫感染真菌およびマグナポルテオリザエ）か、エンテロトキシンドメイン含有遺伝子を含まない（すなわち、この研究における残りの子嚢菌）のいずれかを含んでいた。アリに感染するOphiocordyceps種のゲノムには、20〜36の推定エンテロトキシンがあり、O。australis-Ghana（n = 20）が最小で、O。kimflemingiae（n = 36）が最大でした。線虫に感染する真菌OphiocordycepsminnesotensisとDrechmeriaconiosporaには、エンテロトキシンPFAMドメインを持つ19個と25個の遺伝子が含まれていました。ボタンタケ目の他の昆虫病原菌は、4〜16個のエンテロトキシン注釈のみを含み、MetarhiziumrobertsiiとCordycepsbassianaが最も多かった（それぞれn = 16とn = 14）。この研究の他の子嚢菌ゲノムには、6つを含む植物病原体M. oryzaeを除いて、エンテロトキシンをコードする遺伝子はありませんでした。

この研究では、すべての真菌遺伝子に基づいて系統樹を構築しました。 PF01375熱に不安定なエンテロトキシンアルファ鎖ドメインが含まれていました。エンテロトキシンは主に細菌種で報告されています（例：参考文献23、24、25）。したがって、4つの細菌エンテロトキシンも含めました。これにより、252のドメイン領域に基づくツリーが作成されました。最初に、細菌および植物に感染する種（M. oryzae）のエンテロトキシンが、動物に感染する種（昆虫および線虫に感染する真菌）の大部分に関してどのようにクラスター化するかを決定しました。これにより、3つの細菌エンテロトキシンが1つのクレードに配置され、4つ目が別のクレードに配置されました（補足図S4）。 Leptospira mayottensisからの1つの細菌エンテロトキシンは、植物に感染するM.oryzaeクレードの外群を形成しました。 M. oryzaeは、ボタンタケ目外に生息しています。そのため、この種の植物病原性エンテロトキシンは外群として使用され、樹木はL. mayottensisに根ざしていました（補足図S4）。この木は、アリに感染する真菌のいくつかのエンテロトキシンが他の昆虫または線虫に感染する種のものと関連していることを示しました。他のエンテロトキシンは独自のクレードを形成しました。これらのアリ感染特異的クレード内で、2つの片側性複合種またはオーストラリス複合種からのエンテロトキシンがしばしば対になりました。 Ophiocordyceps subramanianii s.l.エンテロトキシンはしばしば片側性またはオーストラリス特異的クレードへの外群を形成しました（補足図S4）。さらに、操作された噛みつき行動中に高度にアップレギュレートされ（すなわち、GeneID Ophio5 | 373補足図S4）、この研究のすべてのアリ感染種（およびO. sinensis、上記を参照）の間で保存されたエンテロトキシンが存在しました。アリを操作する種だけを含むクレード内。これは、この特定のエンテロトキシンが、この研究に含まれる種で観察されたように、操作された行動を確立する上で実際に重要である可能性があることを示しています。