I granchi a ferro di cavallo sono talvolta chiamati “fossili viventi” perché esistono in qualche forma da oltre 450 milioni di anni. In questo periodo, la Terra ha ha attraversato più ere glaciali importanti, un Grande Morire, la formazione e la successiva disgregazione di Pangea e un impatto con un asteroide che ha ucciso ancora una volta i dinosauri e la maggior parte della vita sulla Terra. In altre parole, i granchi a ferro di cavallo hanno davvero visto un po di merda.
Eppure, suppongo, alcune delle loro esperienze più strane devono essere avvenute solo negli ultimi decenni, come uno dei mammiferi dal corpo molle che è venuto dopo che i dinosauri hanno iniziato a usare le mani per raccogliere granchi a ferro di cavallo fuori dalloceano in massa. Gli umani contemporanei non uccidono deliberatamente i granchi a ferro di cavallo, come hanno fatto secoli precedenti di agricoltori che li catturavano per fertilizzanti o pescatori che li usavano come esca. granchi puliti dai cirripedi, piegano i loro carapaci provvisti di cardini e attaccano acciaio inossidabile el aghi in un punto morbido e debole, al fine di prelevare il sangue. Il sangue di granchio a ferro di cavallo scorre blu e opaco, come lantigelo mescolato al latte.
E per cosa esattamente gli esseri umani hanno bisogno del sangue di un fossile vivente? Una sorta di stregoneria, si potrebbe dire, perché mantiene letteralmente in vita le persone. Il sangue di granchio a ferro di cavallo è squisitamente sensibile alle tossine dei batteri. Viene utilizzato per testare la contaminazione durante la produzione di tutto ciò che potrebbe entrare nel corpo umano: ogni iniezione, ogni flebo e ogni dispositivo medico impiantato.
La moderna industria biomedica è così dipendente da questo sangue che la scomparsa dei granchi a ferro di cavallo lo paralizzerebbe immediatamente. E negli ultimi anni, i granchi a ferro di cavallo, in particolare in Asia, sono stati sottoposti a una serie di minacce: perdita di habitat poiché le dighe marine sostituiscono le spiagge dove si riproducono, inquinamento, pesca eccessiva per uso alimentare ed esca. I granchi a ferro di cavallo dissanguati per uso biomedico negli Stati Uniti vengono restituiti alloceano, ma si stima che anche 50.000 muoiono nel processo ogni anno.
Cè un altro modo, però, un modo per la medicina moderna di utilizzare la tecnologia moderna piuttosto che il sangue di un animale antico. Un sostituto sintetico del sangue di granchio a ferro di cavallo è disponibile da 15 anni. Questa è la storia di come gli scienziati sono riusciti tranquillamente a superare milioni di anni di evoluzione e perché il resto del mondo ha impiegato così tanto tempo per mettersi al passo.
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Jeak Ling Ding dice di essere stata “sempre una topa da laboratorio”, il tipo di biologa che indossava camici bianchi piuttosto che il tipo che guadagnava nel fango. Eppure, a metà degli anni 80, si ritrovò a schiacciare nel fango alla ricerca di granchi a ferro di cavallo. lestuario in cui vivevano, ricorda in modo discreto, “non aveva un odore molto dolce”.
Ding, insieme a suo marito e alla ricerca il partner Bow Ho, era arrivato ai granchi a ferro di cavallo in modo tortuoso e il loro obiettivo finale era quello di rendere gli animali non più necessari nella ricerca biomedica. A quel tempo, era una biologa molecolare presso la National University of Singapore, e il dipartimento di fecondazione in vitro di un ospedale era venuto a Ding and Ho con un problema: i loro embrioni non sarebbero sopravvissuti abbastanza a lungo, potrebbe essere a causa della contaminazione batterica ?
Un test standard allepoca – e ora – è LAL, che sta per limulus amebocyte lysate. Limulus si riferisce a Limulus polyphemus, la specie di granchio a ferro di cavallo originaria della costa atlantica del Nord America. Lamebocita si riferisce alle cellule nel sangue del granchio. E il lisato è il materiale liberato dalle cellule una volta che sono state “lisate” o rotte. Questa è la sostanza squisitamente sensibile alle tossine batteriche.
La prima persona a capirlo su LAL è stata Frederik Bang. Trenta anni prima di Ding, e a 9.000 miglia di distanza a Cape Cod, anche lui raccoglieva granchi a ferro di cavallo sulla riva (per ragioni non del tutto comprese, i granchi a ferro di cavallo si trovano solo lungo le coste orientali del Nord America e dellAsia). era interessato al sistema immunitario primitivo della creatura. Ha stabilito un protocollo per iniettare i batteri dallacqua di mare direttamente nei granchi a ferro di cavallo, che fanno sì che il loro sangue si aggreghi in “masse filamentose”.
Bang sospettava che questa coagulazione avesse uno scopo. Ha immobilizzato i batteri, isolando il resto del corpo del granchio a ferro di cavallo da un agente patogeno invasore. Curiosamente, il loro sangue si è trasformato in gel anche se prima ha bollito liniezione di batteri per cinque o 10 minuti. Questo avrebbe dovuto uccidere i batteri e sterilizzare la soluzione iniettata. Bang si rese conto che il sangue era sensibile non solo ai batteri vivi, ma alle tossine batteriche che persistono anche dopo la sterilizzazione.
Il sistema immunitario umano può essere molto più sofisticato di quello di un granchio a ferro di cavallo, ma anchesso reagisce a queste tossine. I medici se ne accorsero per la prima volta alla fine del XIX secolo, quando i pazienti a cui erano state somministrate iniezioni sterili, tuttavia, soffrirono di “febbre da iniezione” o “febbre salina”. Nel peggiore dei casi, le tossine possono causare shock settico e persino la morte.
Allepoca in cui Bang stava facendo questa ricerca negli anni 50, il modo standard per testare le tossine batteriche era quello di iniettare un campione nei conigli. Era necessario che qualcuno venisse a controllare la temperatura dei conigli ogni 30 minuti per tre ore alla ricerca di segni di febbre, che suggerirebbero una contaminazione batterica.
microscopio, anche le cellule del sangue del coniglio avevano la tendenza a raggrupparsi attorno alla tossina, una somiglianza che Bang notò nel suo articolo del 1956 sul sangue di granchio a ferro di cavallo. Nel decennio e mezzo successivo, lui e un giovane patologo di nome Jack Levin hanno ideato un modo standardizzato per estrarre LAL. Non è stato fino al 1977, tuttavia, che la Food and Drug Administration ha consentito alle aziende farmaceutiche di sostituire le loro grandi colonie di conigli con kit LAL. Ora hai semplicemente aggiunto LAL al materiale testato e capovolto la fiala per vedere se diventava solida, molto più velocemente e più conveniente. Il test LAL richiedeva ancora luso di animali, ma il macabro processo di infilare gli aghi negli animali è stato nascosto e affidato a una parte diversa della catena di approvvigionamento.
Quando Ding stava cercando i granchi a ferro di cavallo a Singapore , LAL era diventata unindustria multimilionaria. Secondo quanto riferito, un litro di sangue di granchio a ferro di cavallo vale fino a $ 15.000. E i kit LAL di cui aveva bisogno per testare la contaminazione degli embrioni IVF erano troppo costosi. Un kit, ricorda, le costava 1.000 dollari a Singapore.
Ecco perché ha pensato di crearsi il suo lisato. Ma la specie di granchio a ferro di cavallo che stava studiando a Singapore, il Carcinoscorpius rotundicauda, è molto più piccola dei granchi a ferro di cavallo dellAtlantico e non potevano essere dissanguati molto senza morire. Quindi Ding ha deciso di creare unalternativa al LAL che alla fine non avrebbe richiesto affatto i granchi a ferro di cavallo.
Ciò che avrebbe richiesto era manipolare il DNA. La sua idea era di unire il gene del granchio ferro di cavallo responsabile della capacità di caccia delle tossine di LAL in cellule che crescono facilmente in un laboratorio, come il lievito. La biotecnologia come campo si stava già muovendo nella direzione del DNA ricombinante, che implica prendere il DNA da una specie e metterlo in unaltra. Alcuni anni prima, nel 1982, Eli Lilly iniziò a vendere insulina umana coltivata in vasche di batteri.
Ding aveva un buon punto di partenza per la sua alternativa LAL. A quel punto, gli scienziati avevano identificato il fattore C, la molecola specifica in LAL che rileva le tossine batteriche. Così ha iniziato a cercare il gene che produce il fattore C. Il suo team di ricerca ha preso le cellule dai granchi a ferro di cavallo che hanno raccolto e le hanno fatte sanguinare in minima parte. (Hanno anche provato, ma non sono riusciti, a coltivare granchi a ferro di cavallo in laboratorio e ad allevarli attraverso la fecondazione in vitro.)
La sensibilità del granchio a ferro di cavallo alle tossine batteriche purtroppo è stato anche un problema studiare. Le tossine, si scopre, sono ovunque: nellacqua, nelle provette, nelle capsule di Petri. “Devi cuocere tutti i bicchieri da forno a 200-220 gradi per diverse ore.” dice Ding. Hanno anche dovuto acquistare acqua speciale che era stata trattata per essere priva di tossine batteriche. Se non stavi attento, il tuo tubo di soluzione potrebbe facilmente trasformarsi in gel.
Quando Ding e Ho finalmente identificato il gene per il fattore C, lhanno unito al lievito. Ciò ha fallito perché mentre il lievito produceva il fattore C, non secerneva la molecola. “Il lievito era molto difficile da rompere. Era molto impuro e disordinato “, dice. Hanno provato un altro tipo di lievito e cellule di mammifero, anche quelle hanno fallito. Alla fine degli anni 90, Ding e Ho frequentarono un corso negli Stati Uniti e impararono a conoscere i sistemi vettoriali di baculovirus. Qui, un virus viene utilizzato per inserire il fattore C nelle cellule intestinali degli insetti, trasformandole in piccole fabbriche per la molecola. Insetti e ferri di cavallo hanno un lignaggio evolutivo condiviso: sono entrambi artropodi. E queste cellule hanno funzionato meravigliosamente.
Infine, un decennio e mezzo dopo aver iniziato, Ding aveva unalternativa a LAL che funzionava senza più danneggiare granchi a ferro di cavallo. Si è rinchiusa in biblioteca per studiare i brevetti e ha redatto la domanda lei stessa. Poi lha mandato via e ha aspettato che il mondo cambiasse.
Il mondo non è cambiato, almeno non per i granchi a ferro di cavallo. Ci sono voluti tre anni prima che il primo kit per il test del fattore C ricombinante basato sul brevetto di Ding uscisse nel 2003, ma anche allora le aziende farmaceutiche hanno mostrato scarso interesse.
Le aziende avevano una serie di ragioni. Cera un solo fornitore del kit, unazienda che oggi fa parte dellazienda chimica svizzera Lonza. Le aziende farmaceutiche erano diffidenti nel fare affidamento su ununica fonte per una parte così importante della loro produzione. E se fosse successo qualcosa a Lonza?O un disastro naturale ha colpito il suo impianto di produzione? Le aziende che sanguinano i granchi rischiano anche di perdere molti soldi se il fattore C sarà ampiamente adottato. Delle sei società con impianti per il dissanguamento dei granchi negli Stati Uniti, due hanno rifiutato le interviste, una non ha risposto a una richiesta di intervista e due non hanno praticamente alcuna presenza pubblica. Il sesto è Lonza, che attualmente vende sia LAL che il fattore ricombinante.
Lonza, da parte sua, ha incolpato la lenta adozione dei regolamenti. Negli Stati Uniti, la FDA dice alle aziende che eseguono test sulle tossine batteriche di seguire la Farmacopea degli Stati Uniti, un manuale che definisce gli standard dei farmaci. In una guida del 2012, la FDA ha affermato che le aziende potrebbero utilizzare il fattore C ricombinante, che non compare nella farmacopea, se effettuassero i propri test di convalida. “Il rischio è, ovviamente, che la FDA potrebbe non accettare la tua convalida e tu non puoi portare il tuo prodotto sul mercato”, afferma Katrin Hoeck, portavoce di Lonza. “Le aziende farmaceutiche sono avverse al rischio”. Anche il settore ha impiegato decenni per passare dai conigli al LAL.
La realtà degli affari è stata una vera delusione per Ding. “Eravamo così entusiasti come ricercatori, così felici che funzionasse”, dice. “E abbiamo pensato che il fattore C ricombinante sarebbe stato adottato in tutto il mondo e il granchio a ferro di cavallo sarebbe stato salvato”.
Di recente, tuttavia, alcune cose hanno cambiato il recente calcolo del rischio-rendimento per le aziende farmaceutiche. Per prima cosa, Lonza non è più lunico fornitore. Nel 2013, Hyglos è diventata la seconda azienda a produrre il fattore ricombinante C. Kevin Williams, uno scienziato senior di Hyglos, afferma di vedere come una modernizzazione attesa da tempo: le aziende farmaceutiche hanno smesso di fare affidamento sui maiali e hanno iniziato a produrre insulina nel lievito e nelle cellule batteriche decenni fa. Perché la stessa tecnologia non può essere applicata allo stesso test utilizzato per verificare che linsulina sia sicura per liniezione?
Dal punto di vista normativo, la Farmacopea europea ha aggiunto il fattore C ricombinante come test accettato per la tossina batterica in 2016, aprendo la strada al cambiamento negli Stati Uniti. Diverse aziende farmaceutiche, in particolare Eli Lilly, hanno confrontato lefficacia del fattore C ricombinante e LAL.
Jay Bolden, un esperto di batteri rilevamento delle tossine presso Eli Lilly, ricorda che Lonza arrivò nei loro laboratori con il kit del fattore C ricombinante oltre un decennio fa. Allepoca era incuriosito ma non era ancora disposto a fare il grande passo. La svolta è arrivata nel 2013, quando Eli Lilly ha iniziato a progettare un impianto per la produzione di insulina in Cina, dove le specie autoctone di granchio a ferro di cavallo sono in declino. “Un giorno sentireste parlare del fatto che un giorno il granchio a ferro di cavallo potrebbe essere limitato”, afferma Bolden. Al contrario, la catena di approvvigionamento per il fattore C ricombinante sembrava più sicura sia con Hyglos che con Lonza come fornitori. LAL e fattore C sono anche comparabili in termini di costi.
Bolden dice che Eli Lilly ha deciso di “tracciare una linea nella sabbia”: tutti i nuovi prodotti dopo un certo punto sarebbero stati testati con il fattore ricombinante C. Lazienda ha recentemente presentato alla FDA la sua prima domanda per un farmaco— galcanezumab per prevenire lemicrania, dove il farmaco finale sarà testato sulla qualità con il fattore C. Ha anche esaminato luso del fattore C ricombinante durante il processo di produzione per testare lacqua e le attrezzature, che attualmente rappresenta la stragrande maggioranza delluso di LAL. Bolden afferma che Eli Lilly ha esercitato pressioni sulla farmacopea statunitense affinché includesse il fattore ricombinante C.
Giovedì Bolden parlerà a Cape May, nel New Jersey, a un evento organizzato da Revive & Restore, unorganizzazione no profit nota per il suo lavoro nel riportare in vita specie estinte. “La nostra missione è utilizzare le biotecnologie per la conservazione”, afferma Ryan Phelan, co-fondatore e direttore esecutivo di Revive & Restore. Phelan ha incontrato Ding per la prima volta quando si è recata a Singapore per un sintetico -conferenza di biologia nel 2017, e ha realizzato la sua ricerca sul fattore C ricombinante si inseriva perfettamente nellintersezione tra conservazione e biotecnologia.
Revive & Restore e i suoi partner per la conservazione – New Jersey Audubon, American Littoral Society e Delaware River Keeper Network – hanno scelto la località di Cape May perché i granchi a ferro di cavallo vengono qui ogni primavera per deporre le uova. Non puoi più catturare il ferro di cavallo granchi qui a causa della loro importanza per una specie di uccelli migratori minacciati chiamata nodo rosso. Questi uccelli si presentano anche qui in primavera. La loro migrazione è programmata in modo che gli uccelli che volano dal Sud America allArtico possano ingozzarsi di caviale uova di granchio a ferro di cavallo Le spiagge diventano nere di granchi, la loro lei Fa un ticchettio mentre le femmine si affrettano a deporre le uova ei maschi per fertilizzarle.I nodi rossi si affrettano a mangiare. Quasi il doppio di peso per il loro viaggio nellArtico.
È unantica sincronia tra le specie, iniziata molto prima che gli umani iniziassero a raccogliere i granchi a ferro di cavallo per il sangue e si spera che durerà molto tempo dopo.