Muurahaista infektoivat Ophiocordyceps-genomit paljastavat mahdollisten käyttäytymiseen liittyvien manipulointigeenien suuren monimuotoisuuden ja mahdollisen tärkeän roolin enterotoksiineille

Genomin ominaisuudet

Tässä tutkimuksessa syntyneet Ophiocordyceps-luonnoksen genomit (Taulukko 1) koottiin lukemilla, jotka oli tuotettu eri sekvensointiajoissa käyttäen kahden tyyppisiä DNA-kirjastoja. Kokoonpanoon käytettiin vain korkealaatuisiin lukemiin johtaneita ajoja (katso Materiaalit ja menetelmät). Contig-kokoonpanon seurauksena genomikoot vaihtelivat välillä 21,91–23,92 miljoonaa emäsparia (Mbp) O. unilateralis s.l. ja O. australis s.l. lajeja. Sitä vastoin O. subramanianii s.l. sen arvioitu genomin koko oli 32,31 Mb. Geeniennuste antoi O. unilateralis- ja O. australis -lajeille 7621-8629 geeniä. Ophiocordyceps subramanianii s.l. ennustettiin olevan 11 275 geeniä. Lisäksi O. subramanianii s.l. (eli 60,35%) oli paljon korkeampi verrattuna muihin tässä tutkimuksessa käytettyihin Ophiocordyceps-lajeihin (54,66% + / – 1,57%) (taulukko 1).

Parannimme myös aiemmin julkaistun O.-genomin kokoonpanoa ja geeniennustusta. unilateralis sl kanta SC16a (täydentävä taulukko S1), jolle on nyt annettu lajinimi O. kimflemingiae 20. Sen lisäksi, että uusi kokoonpano on vähemmän pirstoutunut, se on pienempi kuin aiemmin raportoitiin18. Tämä johtuu todennäköisesti toistuvien alueiden paremmasta kokoonpanosta, joka havaittiin eniten unilateralis-lajeilla (6,59–6,83%) verrattuna muihin tässä tutkimuksessa muurahaista infektoiviin lajeihin (taulukko 1). Pienemmästä kokoonpanokoosta huolimatta uusi geeniennuste lisäsi geenimäärää 798 geenillä. Tämä kasvu johtuu pääasiassa vähemmän kimeerien (ts. Vierekkäin yhdeksi geenimalliksi sulautettujen vierekkäisten geenien) ennustamisesta käyttäen Braker1-putkea (tietoja ei näytetä).

Kaikille paitsi yhdelle genomissa Tässä tutkimuksessa geeniennuste ilmoitettiin RNA-Seq-lukemilla. Aiemmin raportoiduille Pohjois-Amerikan unilateralis-lajeille O. kimflemingiae käytettiin aikaisemmassa tutkimuksessa luotuja lukuja18. Brasilialaisen O. camponoti-rufipediksen viljelyn vaikeuksien takia ei saatu riittävästi materiaalia RNA-Seq-tietojen tuottamiseksi genomi-luonnoksen saamiseksi tarvittavien DNA-lukujen lisäksi. Koska sekä O. kimflemingiae että O. camponoti-rufipedis asuvat samassa lajikompleksissa (unilateralis), yritimme kartoittaa Pohjois-Amerikan unilateralis-lajien lukemia O. camponoti-rufipedis -genomille, jotta voidaan nähdä, voisiko niitä käyttää merkintöjen antamiseen. Vaikka 93% O. kimflemingiaesta lukee kartoitettuna omaan genomiinsa, vain 43% O. camponoti-rufipedis -genomiin (täydentävä taulukko S2). Kartoitimme lukemat lisäksi toiselle julkaistulle O. unilateralis s.l. genomin, O. polyrhachis-furcata 22: n, määrittämiseksi, olisiko tämä yleisempi ristikartoitusvaikutus vai spesifinen O. camponoti-rufipedis -genomille. Tuloksena oli samanlainen 41 prosentin kartoitus. Tämä viittaa siihen, että unilateralis-lajit saattavat yleensä olla suhteellisen kaukana toisistaan, mikä tekee ristikartoituksen annotuksen antamiseksi vähemmän sopivaksi. Tiedotustarkoituksessa kartoitimme myös australis-lajit keskenään (kannat MAP-64 Brasiliasta ja 1348a Ghanasta). Tämä johti 71% ristikartoitettuihin lukemiin verrattuna 86% ja 97% omiin genomeihinsa (vastaava taulukko S2). Tämä tarkoittaa, että australis-kompleksin lajit ovat todennäköisesti paljon läheisempää sukua toisiinsa kuin lajit unilateralis-kompleksissa.

Ortologiset klusterit

Lähdimme tutkimaan, mitkä geeniennusteet tässä tutkimuksessa muurahaista infektoivat Ophiocordyceps-lajit ovat todennäköisesti konservoituneet ja jaettu muiden ascomycetesien kanssa. Lisäksi pyrimme selvittämään, mitä lajikohtaisia ja ”manipulointikohtaisia” erikoistumisia on voinut tapahtua. Sellaisena viiden muurahaista tarttuvan sienen ennustettuja proteomeja verrattiin 18 muun syöpäsairauden sieniin. Näistä lajeista kymmenen olivat eläinparasiitteja (kaksi tarttuvaa nisäkästä, kaksi tarttuvaa nematodia ja kuusi tarttuvaa hyönteistä) ja 13. asuvat samassa järjestyksessä (Hypocreales) .Neljä lajia kuului samaan perheeseen (Ophiocordycipitaceae) ja kaksi samaan sukuun (Ophiocordyceps). kussakin näistä organismeista läsnä olevaan 67 konservoituneeseen geeniin perustuva fylogeneettinen rekonstruktio on esitetty kuvassa 2.

Yhteensä 51 012 ortologista klusteria sisälsi kaikki merkityt proteiinit jokaisesta tähän analyysiin sisältyvästä 23 ascomycetesta (täydentävät tiedot S1). Tätä klusterointia koskevat yhteenvetotilastot löytyvät täydentävästä kuvasta S1. Verrattiin ortologisten klustereiden päällekkäisyyttä kolmen laji-alueen välillä: 1) muurahaista infektoivat sienet, jotka käsittivät kaikki viisi tässä tutkimuksessa syntynyttä luonnosgenomia, 2) muut hyönteisiä infektoivat sienet Ophiocordyceps sinensis, Tolypocladium inflatum, sekä Metarhizium että molemmat Cordyceps-lajit ja 3) kaikki ei-hyönteistartuttavat ascomyketit, joihin sisältyivät muut eläimiä infektoivat, kasveja infektoivat, sieniä infektoivat ja saprofyyttiset sienet. Tämän analyysin tulokset on kuvattu kuvion 3a Venn-kaaviossa. Sen jälkeen teimme rikastusanalyysit muuntogeeniä infektoivien lajien geenien toiminnallisille merkinnöille, jotka löytyivät kaavion eri päällekkäisistä ja päällekkäisistä osista. Kaikista kolmesta lajialueesta löydetystä 7 931 ortologisesta klusterista yleisten biologisten prosessien geenin ontologian (GO) merkinnät olivat merkittävästi yliedustettuina. Tämä viittaa siihen, kuten voidaan odottaa, että erilaisilla elämäntavoilla ascomycetes käyttää samankaltaisia mekanismeja yleisissä prosesseissa, kuten transkriptio, translaatio, proteiinin kuljettaminen ja signaalitransduktio. Geenien, joiden ennustetaan koodaavan (pieniä) erittyviä proteiineja, proteiineja, joilla on GO-merkintöjä usean organismin prosesseille ja patogeneesille, ja tarkemmin sanottuna eriteltyjä oletettuja enterotoksiineja, oli aliedustus. Todellakin, kun teimme rikastusanalyysin ortologisissa klustereissa olevista merkinnöistä, jotka löytyivät vain muurahaista tarttuvista lajeista (ts. 6672 klusteria, kuva 3a), löysimme päinvastaisen tuloksen. GO-merkinnät (suurelta osin samoille) yleisille biologisille prosesseille olivat merkittävästi aliedustettuina, kun taas (pienet) erittyvät proteiinit, proteiinit, joissa oli GO-merkintöjä moniorganismiprosesseille ja patogeneesille, ja oletetut enterotoksiinit olivat yliedustettuina. Tämä viittaa siihen, että merkittävä osa tässä tutkimuksessa muurahaista infektoivien sienien eritystä on spesifinen heille. Tämä spesifisyys ilmestyi osittain enterotoksiineista, jotka ovat osa sekretomia, ja bioaktiivisista pienistä erittyvistä proteiineista (SSP), jotka voivat olla tärkeitä sieni-ant-vuorovaikutuksessa. (Pienet) erittyvät proteiinit olivat myös yliedustettuina niiden klustereiden joukossa, joita muurahaisinfektio-sienet jakavat yksinomaan joko muiden entomopatogeenien (262 klusteria) tai muiden kuin entomopatogeenien (449 klusterin) kanssa. Tämä osoittaa, että niiden sekretomit sisältävät myös yleisempiä entomopatogeenispesifisiä proteiineja sekä proteiineja, jotka jaetaan yksinomaan ei-entomopatogeenisten ascomykettien kanssa.

Tutkimme myös, kuinka ortologiset klusterit, jotka löytyivät vain muurahaista tarttuvista sienistä, olivat näiden lajien edustamia (kuva 3b). Tämän vertailun 6672 klusterista 90,6% näytti olevan lajikohtainen. Klusterien päällekkäisyys oli siten marginaalinen, vaikka kaikki tämän tutkimuksen lajit asuvat samassa suvussa (Ophiocordyceps) ja joissakin tapauksissa jopa samassa lajikompleksissa (O. unilateralis s.l. ja O. australis s.l.). Funktionaalisten merkintätermien rikastumisen analysointi näissä lajeille spesifisissä klustereissa johti jälleen (pienten) erittyvien proteiinien yliedustukseen. Vaikka marginaalinen, suurin osa klusterien päällekkäisyydestä havaittiin läheisempien sukulaislajien välillä samassa kompleksissa (ts. O. australis s.l., 289 klusteria ja O. unilateralis s.l., 182 klusteria Kuva 3b). Myös tässä rikastusanalyysit paljastivat (pienten) erittyvien proteiinien yliedustuksen. Täten näyttää siltä, että tilastollisesti merkittävä määrä näiden muurahaista infektoivien lajien sieni-eritystä on joko monimutkainen tai lajikohtainen. Lisäksi havaitsimme patogeenisyyden GO-termien yliedustuksen kompleksikohtaisten ortologisten klustereiden joukossa. Tämä havainto voidaan katsoa johtuvan ortologisten enterotoksiinien esiintymisestä saman kompleksin lajeissa.Ainoastaan neljä klusteria, joita ei ollut läsnä missään muussa vertailumme ascomysioissa, jaettiin kaikkien viiden muurahaista infektoivan lajin välillä (kuva 3b). Kukaan näistä neljästä klusterista ei saanut toiminnallista merkintää, mutta kolme niistä sisälsi geenejä, joilla oli ennustettuja erityssignaaleja. Kolme neljästä klusterista, geenien BLASTp-analyysi NCBI-tietokantaa vastaan johti yksinomaan hypoteettisiin proteiinihitteihin aiemmin talletetun O. kimflemingiae -genomin version18 kanssa. Tämä osoittaa, että nämä klusterit saattavat todellakin edustaa proteiineja, jotka ovat ainutlaatuisia muurahaista infektoiville Ophiocordyceps-lajeille. Neljännen klusterin proteiinisekvenssit johtivat osumiin metalliproteeaaseilla sen lisäksi, että ne kohdistuivat jälleen hypoteettisen proteiinin kanssa O. kimflemingiaesta (XA68_3159) (täydentävä taulukko S3). Tämä klusteri voi siten sisältää oletettuja metalloproteaaseja, joita esiintyy yksinomaan tässä tutkittujen muurahaista infektoivien sienilajien genomeissa. Lisäksi vain 2 klustereista, jotka löydettiin yksilöllisesti muurahaista tarttuvista sienistä, jaettiin kaikkien neljän puremiskäyttäytymistä indusoivan lajin kesken (kuvio 3b). Näiden klustereiden geenien BLASTp-analyysi johti jälleen hypoteettisiin proteiinihitteihin aiemmin talletetun O. kimflemingiae -genomin version 18 kanssa (täydentävä taulukko S4).

Hakijamanipulointigeenit, jotka liittyvät puremiskäyttäytymisen määrittämiseen

Analysoimme tartunnan saaneissa muurahaisissa havaittuun manipuloituun puremiseen liittyvien ehdokasgeenien säilymistä. Käytimme aiemmin julkaistuja transkriptiotietoja18 ja määritimme uudelleen differentiaalisen geeniekspression kartoittamalla tiedot O. kimflemingiae -genomin uuteen versioon. Aiemmin julkaistun tutkimuksen mukaisesti seurasimme päättelyä siitä, että manipuloidun puremiskäyttäytymisen muodostamiseen osallistuvat ehdokasgeenit olisivat säänneltyjä tämän tapahtuman aikana ja nopeasti alaspäin. Sellaisena tunnistettiin 547 ehdokasgeeniä, mikä on 49 enemmän kuin edellisessä analyysissä18 raportoitiin. Aikaisemmin raportoitujen tietojen mukaisesti geenit, jotka osallistuivat DNA-replikaatioon, hapettumis-pelkistysprosesseihin, eritykseen ja sekundääriseen aineenvaihduntaan, olivat yliedustettuina.

Ehdokasmanipulointigeenien säilyttämistä analysoitiin myös ortologisen klusterin avulla. Verrattiin ortologisten klustereiden päällekkäisyyttä niitä ehdokasgeenejä, jotka olivat merkittävästi ylös- ja alas säädeltyjä O. kimflemingiae -yrityksen manipuloidun puremiskäyttäytymisen jälkeen, kolmeen lajialueeseen: 1) muut muurahaista infektoivat sienet, jotka muodostivat neljä uutta luonnosta tässä tutkimuksessa syntyneet genomit, 2) muut hyönteisiä infektoivat sienet ja 3) kaikki aikaisemmin vertailussa käytetyt ei-hyönteistartuttavat ascomyketit. Tämän analyysin tulokset on kuvattu kuvion 4 Venn-kaaviossa. Ehdokasmanipulointigeeneistä 78% näytti olevan ortologeja geeneistä, joita esiintyy kaikissa kolmessa muussa lajialueessa (ts. 423 klusteria, kuva 4). Tämä tarkoittaa, että O. kimflemingiaen aiheuttaman manipuloidun puremisen aikana ilmaistut geenit eivät todennäköisesti ole spesifisiä manipulaatiolle. Näiden laajasti jaettujen geenien joukossa CYP: t ja muut hapettumiseen pelkistykseen liittyvät toiminnot olivat yliedustettuina, samoin kuin eriteltyjä proteiineja ja proteaaseja koodaavat geenit. Eri toissijaisen aineenvaihdunnan merkinnät (klusterit 7,8 ja 9) olivat myös yliedustettuina näiden laajemmin jaettujen ortologisten klustereiden joukossa. Ne käsittivät tryptofaanidimetyyliallyylitransferaasin, joka osallistui torajyväalkaloidisynteesiin, erilaisia sytokromeja, pieniä erittyviä proteiineja, polyketidisyntaasi (PKS) ja PKS-NRPS (ei-ribosomaalinen proteiinisyntaasi) -hybridi. Niistä ehdokkaan manipulointigeeneistä, jotka näyttivät olevan ainutlaatuisia O. kimflemingiae: lle (eli 59 klusteria, kuva 4), vain SSP: t olivat yliedustettuja. Kuitenkin 92% näistä ”ainutlaatuisista” geeneistä ei saanut toiminnallista merkintää. Jos havaittiin muita päällekkäisyyksiä kolmen laji-alueen kanssa, myös SSP: t olivat yliedustettuina, samoin kuin suuremmat erittyvät proteiinit. sienet (eli 24 klusteria Kuva 4), taas suurin osa (79%) ei saanut toiminnallista merkintää.Seitsemästä ortologisesta klusterista, joita esiintyi kaikissa hyönteisiä tartuttavissa lajeissa, mutta ei muissa ascomyceteissä, löysimme oletetun, Tämä enterotoksiini oli läsnä purevaa käyttäytymistä aiheuttavissa lajeissa: O. kimflemingiae (kaksi ortologia), O. camponoti-rufipedis (1 ortologi), O. subramanianii sl (kaksi ortologia) ja O. australis-Ghana (kaksi ortologia). , samoin kuin O. australis-Brazilissa ja O. sinensisissa. Lisäksi yksi O. kimflemingiaen kahdesta enterotoksiini-ortologista osoitti dramaattista ilmentymismallia > 3000-kertaisella -säätö manipuloinnin aikana ja 200-kertainen alaspäin säätö 18 jälkeen. Tämä enterotoksiini voisi siten mahdollisesti olla tärkeä avainasemassa näiden Ophiocordyceps-lajien käyttäytymisen manipuloinnissa.

Sekundaaristen metaboliittijoukkojen säilyttäminen

Yleinen hypoteesi on, että isäntäkäyttäytyminen muuttuu vakiinnuttamalla toissijaisten metaboliittien erityksen kautta suurempien bioaktiivisten yhdisteiden lisäksi . Tätä hypoteesia tukee tiettyjen annotoitujen toissijaisten metaboliittijoukkojen yliedustus O. kimflemingiae -geenien joukossa, joita säädellään ylös manipuloidun puremiskäyttäytymisen aikana18. Tarkasteltaessa näitä tarkemmin, havaitsimme, että todellakin geenit, jotka olivat annotoitujen sekundaaristen metaboliittijoukkojen sisällä, mutta myös suoraan niiden vieressä, noudattivat tätä erityistä ilmentymismallia (kuvio 5a). Kysyimme, olivatko nämä klusterit säilyneet hyönteisiä tarttuvissa Ophiocordyceps-sienissä. Tämä viittaa samankaltaisuuteen näiden sienien sekundääristen metaboliittien käytössä vuorovaikutuksessa muurahaisisäntiensä kanssa havaitun manipuloidun käyttäytymisen toteamiseksi. Sellaisena tutkimme O. kimflemingiae: n huomautetut klusterit 7,8 ja 9 ja niiden suoraan reunustavat geenit. Näitä klustereita 1) säädeltiin ylös manipuloidun puremiskäyttäytymisen aikana, jota seurasi merkittävä alasregulaatio, ja 2) jaettuja ortologeja muiden ascomykeettien kanssa (katso yllä). Näiden klustereiden geenejä varten etsimme homologeja (BLASTp-kohdistus) ja ortologeja (ortologinen klusterointi) muissa neljässä muurahaista infektoivassa sienessä (kuva 5b ja täydentävä kuva S3). Tämä osoitti, että unilateralis-lajit organisoivat ainakin osan sekundääriseen aineenvaihduntaan liittyvistä geeneistä pääosin samanlaisiksi klustereiksi. Muilla Ophiocordyceps-lajeilla näiden sekundaarisen aineenvaihdunnan geenien homologit ja ortologit olivat hajallaan koko genomissaan tai eivät lainkaan kopiota (kuvio 5b ja täydentävä kuva S3). Esimerkiksi O. kimflemingiae: n huomautettu klusteri 8 sisälsi tryptofaanidimetyyliallyylitransferaasia, jota reunustivat hapettumiseen pelkistykseen liittyvät CYP: t ja geeni, jolla oli FAD-sitoutumisdomeeni. Tätä klusteria reunustavat suoraan seitsemän geeniä, jotka noudattivat samanlaista ekspressiomallia (kuvio 5a). O. camponoti-rufipediksen genomissa oli tämä tryptofaanidimetyyliallyylitransferaasi samalla tavalla; vieressä CYP: t ja FAD: ta sitova geeni, jota seuraavat naapurigeenien homologit ja ortologit (kuvio 5b). O. subramanianii s.l. genomissa oli myös samanlainen tryptofaanidimetyyliallyylitransferaasi. Sitä reunustivat kuitenkin ei-homologiset / ortologiset CYP- ja FAD-sitoutuvat geenit. Itse asiassa O. subramanianii s.l. heillä oli näiden geenien homologeja / ortologeja, mutta ne asuivat täysin erilaisissa jatkoyksiköissä, samoin kuin geenit aivan annotoidun sekundaarisen metaboliittiklusterin ulkopuolella (kuvio 5b). Lisäksi molemmilla australis-lajeilla ei ollut ortologista / homologista geeniä, joka koodaisi tätä nimenomaista tryptofaanidimetyyliallyylitransferaasia. Itse asiassa Ghanan australislajit näyttivät sisältävän oletettua tryptofaanidimetyyliallyylitransferaasia. Samanlaisia johtopäätöksiä voitaisiin tehdä analysoimalla muita sekundaarisia metaboliittiklustereita (täydentävä kuva S3). O. kimflemingiae -ryhmät 7 ja 9 näyttivät suurelta osin verrattavissa O. camponoti-rufipediksen ryhmiin 31 ja 8. Silti näihin klustereihin liittyviä geenejä ei jälleen ollut tai niitä oli hajallaan kolmen muun muurahaista infektoivan lajin genomeissa.

Sienen enterotoksiinien fülogeneesi

Geenit, jotka sisälsivät annotoidun enterotoksiinin PFAM-domeenin (PF01375) ja erityssignaalin, ilmoitettiin oletetuina, erittyvinä enterotoksiineina. Aikaisemmat tulokset ja nykyinen tutkimus viittaavat siihen, että näitä oletettuja enterotoksiineja koodaavat geenit ovat tärkeitä käyttäytymistä manipuloivissa Ophiocordyceps-sienilajeissa.Nämä erittyvät bakteerimaiset toksiinit voivat mahdollisesti vaikuttaa muurahaiskäyttäytymiseen häiritsemällä kemosignaalimolekyylien tuotantoa isännässä. Tämä osoitettiin bakteerien entomopatogeenien enterotoksiineille boll-kärsivien sukupuoliferomoneissa23,24. Ne voivat kuitenkin toimia myös pelkästään tappavina yhdisteinä25. Lisäksi yksi näistä oletetuista enterotoksiineista oli erittäin voimakkaasti säädelty vain manipuloidun puremisen aikana18. Tätä erityistä geeniä oli läsnä kaikissa tässä tutkimuksessa muokkaavilla muokkaavilla Ophiocordyceps-lajeilla, samoin kuin O. australis-Brazil ja O. sinensis. Lisäksi muurahaista infektoivilla sienillä näytti olevan melko suuri määrä geenejä, jotka koodaavat näitä patogeenisyyteen liittyviä proteiineja. Muut ascomycetes sisälsivät joko huomattavasti vähemmän (ts. Muita entomopatogeeneja, sukkulamatoja infektoivia sieniä ja Magnaporthe oryzae) tai ei mitään enterotoksiinidomeenia sisältäviä geenejä (ts. Loput ascomyceteistä tässä tutkimuksessa). Muurahaista tarttuvien Ophiocordyceps-lajien genomeissa oli 20–36 oletettua enterotoksiinia, joista O. australis-Ghana (n = 20) oli pienin ja O. kimflemingiae (n = 36) eniten. Nematodia infektoivat sienet Ophiocordyceps minnesotensis ja Drechmeria coniospora sisälsivät 19 ja 25 geeniä, joilla oli enterotoksiini PFAM -domeeni. Muut Hypocreales-luokan entomopatogeenit sisälsivät vain 4–16 enterotoksiini-merkintää Metarhizium robertsiin ja Cordyceps bassianan kanssa (n = 16 ja n = 14, vastaavasti). Tässä tutkimuksessa muissa ascomycete-genomeissa ei ollut enterotoksiinia koodaavia geenejä, lukuun ottamatta kasvipatogeenia M. oryzae, joka sisälsi kuusi.

Rakensimme filogeneettisen puun, joka perustui kaikkiin tämän tutkimuksen sienigeeneihin. sisälsi PF01375-lämpölabiilin enterotoksiinialfaketjun domeenin. Enterotoksiineja on raportoitu enimmäkseen bakteerilajeista (esim. Viitteet 23,24,25). Siksi sisällytimme myös neljä bakteerien enterotoksiinia. Tuloksena oli puu, joka perustui 252 toimialueeseen. Määritimme ensin, kuinka bakteerien ja kasvien infektoivien lajien (ts. M. oryzae) enterotoksiinit klusteroituisivat suhteessa suurimpaan osaan eläimiä infektoivista lajeista (ts. Hyönteisten ja sukkulamatojen tartuttavat sienet). Tämä sijoitti kolme bakteeri-enterotoksiinia yhteen kladiin ja neljännes erilliseen kladiin (täydentävä kuva S4). Yksi bakteerien enterotoksiini, Leptospira mayottensis, muodosti alaryhmän kasveja infektoivaan M. oryzae -kladiin. M. oryzae asuu Hypocreales-järjestyksen ulkopuolella. Sellaisena tämän lajin kasvipatogeenisiä enterotoksiineja käytettiin ulkopuolisena ryhmänä ja puu juurtui L. mayottensiksen (täydentävä kuva S4). Tämä puu osoitti, että jotkut muurahaista infektoivien sienien enterotoksiinit ovat sukua muiden hyönteisiä tai sukkulamatoja infektoivien lajien syöpään. Muut enterotoksiinit muodostivat oman pintansa. Näissä muissa infektiospesifisissä ryhmissä enterotoksiinit kahdesta unilateralis-kompleksikompleksista tai australis-kompleksi-lajista yhdistettiin usein. Ophiocordyceps subramanianii s.l. enterotoksiinit muodostivat usein alaryhmän yksipuoliselle tai australis-spesifiselle ryhmälle (täydentävä kuva S4). Lisäksi manipuloidun puremiskäyttäytymisen aikana voimakkaasti säädelty enterotoksiini (eli GeneID Ophio5 | 373 täydentävä kuva S4), joka oli säilynyt kaikkien tämän tutkimuksen (ja O. sinensis, ks. Edellä) joukossa, asui sisällä kladissa, joka sisälsi vain muurahaisia manipuloivia lajeja. Tämä osoittaa, että tällä erityisellä enterotoksiinilla voi todellakin olla keskeinen merkitys manipuloidun käyttäytymisen toteamisessa, kuten havaitaan tässä tutkimuksessa mukana olevilla lajeilla.