Ant-infizierende Ophiocordyceps-Genome zeigen eine große Vielfalt potenzieller Gene zur Manipulation des Verhaltens und eine mögliche Hauptrolle für Enterotoxine

Genommerkmale

Die in dieser Studie erzeugten Ophiocordyceps-Entwurfsgenome (Tabelle 1) wurden mit Reads zusammengestellt, die über verschiedene Sequenzierungsläufe unter Verwendung von zwei Arten von DNA-Bibliotheken erzeugt wurden. Für die Montage wurden nur die Läufe verwendet, die zu qualitativ hochwertigen Lesevorgängen führten (siehe Materialien und Methoden). Die Contig-Assemblierung führte zu Genomgrößen im Bereich von 21,91 bis 23,92 Millionen Basenpaaren (Mbp) für O. unilateralis s.l. und O. australis s.l. Spezies. Im Gegensatz dazu ist O. subramanianii s.l. hatte eine geschätzte Genomgröße von 32,31 Mb. Die Genvorhersage ergab zwischen 7.621 und 8.629 Gene für die Arten O. unilateralis und O. australis. Ophiocordyceps subramanianii s.l. wurde vorausgesagt, 11.275 Gene zu haben. Zusätzlich wurde der GC-Gehalt in O. subramanianii s.l. (dh 60,35%) war im Vergleich zu den anderen Ophiocordyceps-Arten in dieser Studie viel höher (54,66% +/- 1,57%) (Tabelle 1).

Wir haben auch die Assemblierung und Genvorhersage des zuvor veröffentlichten Genoms von O verbessert. unilateralis sl Stamm SC16a (Ergänzungstabelle S1), der jetzt den Artnamen O. kimflemingiae 20 erhalten hat. Die neue Anordnung ist nicht nur weniger fragmentiert, sondern auch kleiner als zuvor berichtet18. Dies ist höchstwahrscheinlich auf eine bessere Ansammlung repetitiver Regionen zurückzuführen, die bei den Unilateralis-Arten (6,59–6,83%) im Vergleich zu den anderen Ameisen-infizierenden Arten in dieser Studie am höchsten waren (Tabelle 1). Trotz der kleineren Baugruppengröße erhöhte die neue Genvorhersage die Genzahl mit 798 Genen. Dieser Anstieg wird hauptsächlich durch die Vorhersage von weniger Chimären (dh benachbarten Genen, die fälschlicherweise zu einem Genmodell zusammengeführt werden) unter Verwendung der Braker1-Pipeline (Daten nicht gezeigt) verursacht.

Für alle bis auf eines der in erzeugten Genome In dieser Studie wurde die Genvorhersage durch RNA-Seq-Reads informiert. Für die zuvor gemeldete nordamerikanische Unilateralis-Art O. kimflemingiae wurden die in dieser früheren Studie generierten Messwerte verwendet18. Durch Schwierigkeiten bei der Kultivierung des brasilianischen O. camponoti-rufipedis wurde nicht genügend Material erhalten, um zusätzlich zu den DNA-Reads, die zum Erhalt eines Entwurfs des Genoms erforderlich sind, RNA-Seq-Daten zu generieren. Da sich sowohl O. kimflemingiae als auch O. camponoti-rufipedis innerhalb desselben Artenkomplexes (unilateralis) befinden, haben wir versucht, die nordamerikanischen Unilateralis-Arten-Reads auf das Genom von O. camponoti-rufipedis abzubilden, um festzustellen, ob sie zur Information über Annotationen verwendet werden können. Während 93% der O. kimflemingiae-Reads auf ihr eigenes Genom abgebildet sind, sind nur 43% auf das O. camponoti-rufipedis-Genom abgebildet (Ergänzungstabelle S2). Wir haben die Reads zusätzlich einem anderen veröffentlichten O. unilateralis s.l. zugeordnet. Genom, das von O. polyrhachis-furcata 22, um zu bestimmen, ob dies ein allgemeinerer Cross-Mapping-Effekt oder spezifisch für das Genom von O. camponoti-rufipedis wäre. Eine ähnliche Zuordnung von 41% ergab sich. Dies deutet darauf hin, dass Unilateralis-Arten im Allgemeinen eher weit entfernt verwandt sind, was eine Kreuzkartierung zur Information über Annotationen weniger geeignet macht. Zu Informationszwecken haben wir auch die Australis-Arten miteinander kartiert (Stämme MAP-64 aus Brasilien und 1348a aus Ghana). Dies führte zu 71% und 82% Cross-Mapping-Reads gegenüber 86% und 97%, die auf ihr eigenes Genom abgebildet wurden (Ergänzungstabelle S2). Dies impliziert, dass Arten im Australis-Komplex wahrscheinlich viel enger miteinander verwandt sind als Arten im Unilateralis-Komplex.

Orthologe Cluster

Wir wollten untersuchen, von welchen Genvorhersagen Die Ameisen-infizierenden Ophiocordyceps-Arten in dieser Studie sind wahrscheinlich konserviert und werden mit anderen Ascomyceten geteilt. Darüber hinaus wollten wir herausfinden, welche speziesspezifischen und „manipulationsspezifischen“ Spezialisierungen stattgefunden haben könnten. Daher wurden die vorhergesagten Proteome unserer fünf Ameisen-infizierenden Pilze mit denen von 18 anderen ascomyketischen Pilzen verglichen. Von diesen zehn Arten waren tierische Parasiten (zwei infizierende Säugetiere, zwei infizierende Nematoden und sechs infizierende Insekten) und 13 leben in derselben Ordnung (Hypocreales). Vier Arten gehörten derselben Familie an (Ophiocordycipitaceae) und zwei gehörten derselben Gattung an (Ophiocordyceps) Die phylogenetische Rekonstruktion basierend auf 67 konservierten Genen, die in jedem dieser Organismen vorhanden sind, ist in 2 dargestellt.

Insgesamt 51.012 orthologe Cluster enthielten alle annotierten Proteine von jedem der 23 in diese Analyse einbezogenen Ascomyceten (ergänzende Daten S1). Zusammenfassende Statistiken zu diesem Clustering finden Sie in der ergänzenden Abbildung S1. Wir verglichen die Überlappung orthologer Cluster zwischen drei Artenbereichen: 1) die ameiseninfizierenden Pilze, die alle fünf in dieser Studie erzeugten Entwurfsgenome umfassten, 2) die anderen insekteninfizierenden Pilze Ophiocordyceps sinensis, Tolypocladium inflatum, beide Metarhizium- und beide Cordyceps-Arten und 3) alle nicht insekteninfizierenden Ascomyceten, einschließlich anderer tierinfizierender, pflanzeninfizierender, pilzinfizierender und saprophytischer Pilze. Die Ergebnisse dieser Analyse sind im Venn-Diagramm von Fig. 3a dargestellt. Anschließend führten wir Anreicherungsanalysen für die funktionellen Annotationen von Ameisen-infizierenden Speziesgenen durch, die in den verschiedenen überlappenden und nicht überlappenden Teilen des Diagramms gefunden wurden. Von den 7.931 orthologen Clustern, die in allen drei Artenbereichen gefunden wurden, waren die Anmerkungen zur Gen-Ontologie (GO) für allgemeine biologische Prozesse signifikant überrepräsentiert. Dies deutet erwartungsgemäß darauf hin, dass Ascomyceten mit unterschiedlichen Lebensstilen ähnliche Mechanismen für allgemeine Prozesse wie Transkription, Translation, Proteintransport und Signaltransduktion verwenden. Gene, von denen vorhergesagt wurde, dass sie für (kleine) sekretierte Proteine, Proteine mit GO-Annotationen für Prozesse und Pathogenese mehrerer Organismen und insbesondere sekretierte mutmaßliche Enterotoxine kodieren, waren jedoch unterrepräsentiert. In der Tat fanden wir das gegenteilige Ergebnis, als wir eine Anreicherungsanalyse von Annotationen durchführten, die in orthologen Clustern vorhanden waren, die nur in der Ameisen-infizierenden Spezies gefunden wurden (d. H. 6.672 Cluster, Fig. 3a). GO-Annotationen für (weitgehend gleiche) allgemeine biologische Prozesse waren signifikant unterrepräsentiert, während (kleine) sekretierte Proteine, Proteine mit GO-Annotationen für Prozesse und Pathogenese mehrerer Organismen und mutmaßliche Enterotoxine überrepräsentiert waren. Dies legt nahe, dass ein wesentlicher Teil des Sekretoms der Ameisen-infizierenden Pilze in dieser Studie spezifisch für sie ist. Diese Spezifität trat teilweise aufgrund von Enterotoxinen auf, die Teil des Sekretoms sind, und bioaktiver kleinsekretierter Proteine (SSPs), die für Pilz-Ameisen-Wechselwirkungen wichtig sein könnten. (Kleine) sekretierte Proteine waren auch unter den Clustern überrepräsentiert, die Ameisen-infizierende Pilze ausschließlich entweder mit anderen Entomopathogenen (262 Cluster) oder Nicht-Entomopathogenen (449 Cluster) teilten. Dies weist darauf hin, dass ihre Sekretome auch allgemeinere entomopathogenspezifische Proteine sowie Proteine enthalten, die ausschließlich mit nicht entomopathogenen Ascomyceten geteilt werden.

Wir haben auch untersucht, wie orthologe Cluster, die nur unter den ameiseninfizierenden Pilzen gefunden wurden, von diesen Arten repräsentiert werden (Abb. 3b). Von den insgesamt 6.672 Clustern in diesem Vergleich schienen 90,6% speziesspezifisch zu sein. Die Clusterüberlappung war daher marginal, obwohl alle Arten in dieser Studie innerhalb derselben Gattung (Ophiocordyceps) und in einigen Fällen sogar innerhalb desselben Artenkomplexes (O. unilateralis s.l. und O. australis s.l.) leben. Die Analyse der Anreicherung funktioneller Annotationsterme in diesen speziesspezifischen Clustern führte erneut zu Überrepräsentationen von (kleinen) sekretierten Proteinen. Obwohl marginal, wurde die meiste Clusterüberlappung zwischen enger verwandten Arten innerhalb desselben Komplexes gefunden (d. H. O. australis s.l., 289 Cluster und O. unilateralis s.l., 182 Cluster, Fig. 3b). Auch hier zeigten Anreicherungsanalysen eine Überrepräsentation für (kleine) sekretierte Proteine. Somit scheint eine statistisch signifikante Menge des Pilzsekretoms dieser Ameisen-infizierenden Spezies entweder komplex oder speziesspezifisch zu sein. Darüber hinaus fanden wir eine Überrepräsentation der Pathogenitäts-GO-Terme unter den komplexspezifischen orthologen Clustern. Dieser Befund könnte auf das Vorhandensein orthologer Enterotoxine in Spezies innerhalb desselben Komplexes zurückgeführt werden.Nur vier Cluster, die in keinem der anderen Ascomyceten in unserem Vergleich vorhanden waren, wurden unter allen fünf Ameisen-infizierenden Arten geteilt (3b). Keiner dieser vier Cluster erhielt eine funktionelle Annotation, aber drei von ihnen enthielten Gene mit vorhergesagten Sekretionssignalen. Für drei der vier Cluster führte eine BLASTp-Analyse der Gene gegen die NCBI-Datenbank ausschließlich zu hypothetischen Protein-Treffern mit der zuvor hinterlegten Version des O. kimflemingiae-Genoms18. Dies weist darauf hin, dass diese Cluster tatsächlich Proteine darstellen könnten, die nur für Ameisen-infizierende Ophiocordyceps-Arten gelten. Proteinsequenzen innerhalb des vierten Clusters führten zu Treffern mit Metalloproteasen zusätzlich zur erneuten Ausrichtung mit einem hypothetischen Protein von O. kimflemingiae (XA68_3159) (Ergänzungstabelle S3). Dieser Cluster könnte daher mutmaßliche Metalloproteasen enthalten, die ausschließlich in den Genomen der hier untersuchten ameiseninfizierenden Pilzarten vorkommen. Darüber hinaus wurden nur 2 der in den Ameisen-infizierenden Pilzen eindeutig gefundenen Cluster auf alle vier Arten aufgeteilt, die ein Beißverhalten induzieren (Abb. 3b). Eine BLASTp-Analyse der Gene innerhalb dieser Cluster führte erneut zu hypothetischen Protein-Treffern mit der zuvor hinterlegten Version des O. kimflemingiae-Genoms18 (Ergänzungstabelle S4).

Kandidatenmanipulationsgene, die an der Ermittlung des Beißverhaltens beteiligt sind

Wir analysierten die Konservierung von Kandidatengenen, die mit dem bei infizierten Ameisen beobachteten manipulierten Beißereignis verbunden sind. Wir verwendeten zuvor veröffentlichte Transkriptomikdaten18 und bestimmten die differentielle Genexpression neu, indem wir die Daten auf die neue Version des O. kimflemingiae-Genoms abbildeten. Gemäß der zuvor veröffentlichten Studie folgten wir der Überlegung, dass Kandidatengene, die an der Etablierung des manipulierten Beißverhaltens beteiligt sind, während dieses Ereignisses hochreguliert und danach schnell wieder herunterreguliert würden. Als solche wurden 547 Kandidatengene identifiziert, 49 mehr als in der vorherigen Analyse berichtet18. In Übereinstimmung mit den zuvor gemeldeten Daten waren Gene, die an der DNA-Replikation, den Oxidations-Reduktions-Prozessen, der Sekretion und dem Sekundärmetabolismus beteiligt sind, überrepräsentiert. Die Konservierung von Kandidaten-Manipulationsgenen wurde auch mittels orthologer Clusterbildung analysiert. Wir verglichen die Überlappung von orthologen Clustern, die jene Kandidatengene enthielten, die nach manipuliertem Beißverhalten in O. kimflemingiae während des manipulierten Beißverhaltens signifikant hoch- und herunterreguliert wurden, mit drei Artenbereichen: 1) den anderen ameiseninfizierenden Pilzen, die die vier neuen Entwürfe umfassten In dieser Studie erzeugte Genome, 2) die anderen insekteninfizierenden Pilze und 3) alle nicht insekteninfizierenden Ascomyceten, die zuvor zum Vergleich verwendet wurden. Die Ergebnisse dieser Analyse sind im Venn-Diagramm von Fig. 4 dargestellt. Von den Kandidaten-Manipulationsgenen schienen 78% Orthologe von Genen zu sein, die in allen anderen drei Speziesbereichen vorhanden waren (d. H. 423 Cluster, Fig. 4). Dies impliziert, dass die Gene, die während des durch O. kimflemingiae induzierten manipulierten Beißens exprimiert werden, wahrscheinlich nicht manipulationsspezifisch sind. Unter diesen weit verbreiteten Genen waren CYPs und andere Funktionen im Zusammenhang mit der Oxidationsreduktion überrepräsentiert sowie Gene, die für sekretierte Proteine und Proteasen kodieren. Verschiedene Annotationen des Sekundärmetabolismus (Cluster 7, 8 und 9) waren auch unter diesen breiter geteilten orthologen Clustern überrepräsentiert. Sie umfassten eine Tryptophandimethylallyltransferase, die an der Mutterkornalkaloidsynthese beteiligt war, verschiedene Cytochrome, kleinsekretierte Proteine, eine Polyketidsynthase (PKS) und ein PKS-NRPS-Hybrid (nicht-ribosomale Proteinsynthetase). Unter den Kandidaten-Manipulationsgenen, die für O. kimflemingiae einzigartig zu sein schienen (d. H. 59 Cluster, Fig. 4), waren nur SSPs überrepräsentiert. 92% dieser „einzigartigen“ Gene erhielten jedoch keine funktionelle Annotation. Wo eine andere Überlappung mit den drei Artenbereichen gefunden wurde, waren auch SSPs überrepräsentiert, ebenso wie größere sekretierte Proteine. Von denen, die nur bei Ameiseninfektionen vorhanden waren Pilze (dh 24 Cluster Abb. 4) erhielt wiederum die Mehrheit (79%) keine funktionelle Annotation. Unter den sieben orthologen Clustern, die in allen insekteninfizierenden Arten, aber nicht in anderen Ascomyceten vorhanden waren, fanden wir einen mutmaßlichen, sekretiertes Enterotoxin Dieses Enterotoxin war in den beißverhaltensinduzierenden Spezies O. kimflemingiae (zwei Orthologe), O. camponoti-rufipedis (1 Ortholog), O. subramanianii sl (zwei Orthologe) und O. australis-Ghana (zwei Orthologen) vorhanden. Darüber hinaus zeigte eines der beiden Enterotoxin-Orthologen in O. kimflemingiae ein dramatisches Expressionsmuster mit einer > 3.000-fachen Vergrößerung -Regulierung während der Manipulation und eine 200-fache Herunterregulierung nach 18. Dieses Enterotoxin könnte daher möglicherweise ein wichtiger Schlüsselakteur bei der Etablierung einer Verhaltensmanipulation durch diese Ophiocordyceps-Arten sein.

Erhaltung von Sekundärmetabolitenclustern

Eine allgemeine Hypothese ist, dass veränderte Wirtsverhalten durch die Sekretion von Sekundärmetaboliten zusätzlich zu größeren bioaktiven Verbindungen hergestellt werden . Diese Hypothese wird durch die Überrepräsentation bestimmter annotierter Sekundärmetabolitencluster unter Genen von O. kimflemingiae gestützt, die während des manipulierten Beißverhaltens hochreguliert werden18. Bei näherer Betrachtung stellten wir fest, dass die Gene innerhalb, aber auch direkt neben den annotierten Sekundärmetabolitenclustern diesem speziellen Expressionsmuster folgten (Abb. 5a). Wir fragten, ob diese Cluster unter insekteninfizierenden Ophiocordyceps-Pilzen konserviert sind. Dies würde auf eine Ähnlichkeit bei der Verwendung von Sekundärmetaboliten durch diese Pilze hinweisen, um mit ihren Ameisenwirten zu interagieren und das beobachtete manipulierte Verhalten festzustellen. Als solches untersuchten wir annotierte Cluster 7, 8 und 9 von O. kimflemingiae und ihre direkt flankierenden Gene. Diese Cluster 1) wurden während des manipulierten Beißverhaltens hochreguliert, gefolgt von einer signifikanten Herunterregulierung, und 2) teilten Orthologe mit anderen Ascomyceten (siehe oben). Für die Gene in diesen Clustern suchten wir nach Homologen (BLASTp-Alignment) und Orthologen (orthologes Clustering) in den anderen vier Ameisen-infizierenden Pilzen (Abb. 5b und ergänzende Abbildung S3). Dies zeigte, dass die unilateralis-Arten zumindest einige ihrer Gene im Zusammenhang mit dem Sekundärstoffwechsel in weitgehend ähnlichen Clustern organisierten. Die anderen Ophiocordyceps-Arten hatten Homologe und Orthologe dieser sekundären Metabolismusgene, die über ihr Genom verstreut waren, oder enthielten überhaupt keine Kopie (Fig. 5b und ergänzende Fig. S3). Beispielsweise enthielt der annotierte Cluster 8 in O. kimflemingiae eine Tryptophandimethylallyltransferase, flankiert von oxidationsreduktionsbezogenen CYPs, und ein Gen mit einer FAD-Bindungsdomäne. Dieser Cluster wird direkt von sieben Genen flankiert, die einem ähnlichen Expressionsmuster folgten (Fig. 5a). Das Genom von O. camponoti-rufipedis hatte diese Tryptophandimethylallyltransferase auf ähnliche Weise; flankiert von CYPs und einem FAD-bindenden Gen, gefolgt von Homologen und Orthologen der benachbarten Gene (Abb. 5b). Die O. subramanianii s.l. Das Genom hatte auch eine ähnliche Tryptophandimethylallyltransferase. Es wurde jedoch von nicht homologen / orthologen CYP- und FAD-bindenden Genen flankiert. Tatsächlich ist O. subramanianii s.l. hatten Homologe / Orthologe dieser Gene, aber sie befanden sich auf völlig unterschiedlichen Contigs, ebenso wie die Gene direkt außerhalb des annotierten sekundären Metabolitenclusters (Fig. 5b). Darüber hinaus hatten beide Australis-Spezies kein orthologes / homologes Gen, das für diese spezielle Tryptophan-Dimethylallyltransferase kodierte. Tatsächlich schienen die Australis-Arten aus Ghana überhaupt keine mutmaßliche Tryptophandimethylallyltransferase zu enthalten. Ähnliche Schlussfolgerungen könnten bei der Analyse der anderen Sekundärmetabolitencluster gezogen werden (ergänzende Abbildung S3). Die Cluster 7 und 9 von O. kimflemingiae schienen weitgehend mit den Clustern 31 und 8 von O. camponoti-rufipedis vergleichbar zu sein. Mit diesen Clustern assoziierte Gene waren jedoch entweder nicht vorhanden oder über die Genome der drei anderen Ameisen-infizierenden Spezies verstreut.

Phylogenie von Pilz-Enterotoxinen

Gene, die eine annotierte Enterotoxin-PFAM-Domäne (PF01375) und ein Sekretionssignal enthielten, wurden als mutmaßliche, sekretierte Enterotoxine angegeben. Frühere Ergebnisse und unsere aktuelle Studie deuten darauf hin, dass Gene, die für diese mutmaßlichen Enterotoxine kodieren, für verhaltensmanipulierende Arten von Ophiocordyceps-Pilzen von Bedeutung sind.Diese sekretierten bakteriellen Toxine könnten möglicherweise das Verhalten von Ameisen beeinflussen, indem sie die Produktion von Chemosignalmolekülen im Wirt stören. Dies wurde für Enterotoxine aus bakteriellen Entomopathogenen in Sexualpheromonen von Rüsselkäfern gezeigt23,24. Sie könnten jedoch auch als bloße Abtötungsverbindungen fungieren25. Darüber hinaus war eines dieser mutmaßlichen Enterotoxine nur während des manipulierten Beißereignisses extrem hochreguliert18. Dieses spezielle Gen war in dieser Studie in allen ameisenmanipulierenden Ophiocordyceps-Arten sowie in O. australis-Brazil und O. sinensis vorhanden. Darüber hinaus schienen die Ameisen-infizierenden Pilze eine ziemlich große Anzahl von Genen zu haben, die für diese Pathogenitäts-verwandten Proteine kodieren. Andere Ascomyceten enthielten im Allgemeinen entweder weit weniger (d. H. Andere Entomopathogene, Nematoden-infizierende Pilze und Magnaporthe oryzae) oder keine Enterotoxin-Domänen enthaltenden Gene (d. H. Den Rest der Ascomyceten in dieser Studie). Die Genome von Ameisen-infizierenden Ophiocordyceps-Arten wiesen 20–36 mutmaßliche Enterotoxine auf, wobei O. australis-Ghana (n = 20) die kleinste und O. kimflemingiae (n = 36) die größte Anzahl aufwies. Nematoden-infizierende Pilze Ophiocordyceps minnesotensis und Drechmeria coniospora enthielten 19 und 25 Gene mit einer Enterotoxin-PFAM-Domäne. Andere Entomopathogene der Ordnung Hypocreales enthielten nur 4–16 Enterotoxin-Annotationen, wobei Metarhizium robertsii und Cordyceps bassiana die meisten hatten (n = 16 bzw. n = 14). Die anderen Ascomyceten-Genome in dieser Studie hatten keine Enterotoxin-kodierenden Gene, mit Ausnahme des Pflanzenpathogens M. oryzae, das sechs enthielt.

Wir haben in dieser Studie einen phylogenetischen Baum basierend auf allen Pilzgenen erstellt enthielt die hitzelabile Enterotoxin-Alpha-Kettendomäne PF01375. Enterotoxine wurden hauptsächlich für Bakterienspezies berichtet (z. B. Lit. 23, 24, 25). Wir haben daher auch vier bakterielle Enterotoxine eingeschlossen. Dies führte zu einem Baum, der auf 252 Domänenregionen basierte. Wir haben zuerst bestimmt, wie sich die Enterotoxine der bakteriellen und pflanzeninfizierenden Spezies (d. H. M. oryzae) in Bezug auf die Mehrheit der tierinfizierenden Spezies (d. H. Insekten- und Nematoden-infizierende Pilze) zusammenlagern würden. Dies platzierte drei bakterielle Enterotoxine in einer Klade und das vierte in einer separaten Klade (ergänzende Abbildung S4). Ein bakterielles Enterotoxin aus Leptospira mayottensis bildete eine Außengruppe für die pflanzeninfizierende M. oryzae-Klade. M. oryzae wohnt außerhalb der Ordnung Hypocreales. Als solche wurden die pflanzenpathogenen Enterotoxine dieser Art als Außengruppe verwendet und der Baum wurde auf L. mayottensis verwurzelt (ergänzende Abbildung S4). Dieser Baum zeigte, dass einige Enterotoxine von Ameisen-infizierenden Pilzen mit denen anderer Insekten- oder Nematoden-infizierender Arten verwandt sind. Andere Enterotoxine bildeten ihre eigenen Kladen. Innerhalb dieser Ameiseninfektions-spezifischen Kladen wurden häufig Enterotoxine aus den beiden Unilateralis-Komplexspezies oder den Australis-Komplexspezies gepaart. Ophiocordyceps subramanianii s.l. Enterotoxine bildeten häufig die Außengruppe einer unilateralis- oder australis-spezifischen Klade (ergänzende Abbildung S4). Darüber hinaus befand sich das Enterotoxin, das während des manipulierten Beißverhaltens stark hochreguliert war (dh GeneID Ophio5 | 373 Supplementary Figure S4) und unter allen in dieser Studie mit Ameisen infizierenden Arten (und O. sinensis, siehe oben) konserviert war innerhalb einer Gruppe, die nur Ameisen manipulierende Arten enthielt. Dies weist darauf hin, dass dieses spezielle Enterotoxin tatsächlich von zentraler Bedeutung für die Feststellung eines manipulierten Verhaltens sein könnte, wie es bei den in diese Studie einbezogenen Arten beobachtet wird.