Ifølge legenden blev byen Rom grundlagt i 753 f.Kr. ved bredden af Tiberen omkring 25 kilometer fra havet ved Ostia. Tiber Island, i midten af floden mellem Trastevere og det gamle centrum, var stedet for en vigtig gammel ford og blev senere broet. Legenden siger, at Roms grundlæggere, tvillingebrødrene Romulus og Remus, blev forladt på dets farvande, hvor de blev reddet af hunulven, Lupa.
Floden markerede grænsen mellem etruskernes lande. mod vest, Sabinerne mod øst og latinerne mod syd. Benito Mussolini, født i Romagna, justerede grænsen mellem Toscana og Emilia-Romagna, så Tiberens kilder ville ligge i Romagna.
Tiberen var kritisk vigtig for den romerske handel og handel, da skibe kunne nå så langt som 100 km op ad floden; der er tegn på, at det blev brugt til at sende korn fra Val Teverina så længe siden som det 5. århundrede f.Kr. Det blev senere brugt til at sende sten, tømmer og levnedsmidler til Rom.
Under de puniske krige i det 3. århundrede f.Kr. blev havnen i Ostia en vigtig flådebase. Det blev senere Roms vigtigste port, hvor hvede, olivenolie og vin blev importeret fra Roms kolonier omkring Middelhavet. Kajer blev også bygget langs t han flodbredden i selve Rom, der ligger langs flodbredderne omkring Campus Martius-området. Romerne forbandt floden med et kloaksystem (Cloaca Maxima) og med et underjordisk netværk af tunneler og andre kanaler for at bringe dets vand ind i midten af byen.
Velhavende romere havde haveparker eller “horti” ved bredden af floden i Rom op gennem det første århundrede f.Kr. Disse kan være solgt og udviklet omkring et århundrede senere.
Den tunge sedimentering af floden gjorde det vanskeligt at vedligeholde Ostia, hvilket fik kejserne Claudius og Trajan til at etablere en ny havn på Fiumicino i det 1. århundrede AD. De byggede en ny vej, via Portuensis, for at forbinde Rom med Fiumicino og forlade byen ved Porta Portese (“portporten”). Begge havne blev til sidst forladt på grund af siltning.
Flere paver forsøgte at forbedre navigationen på Tiberen i det 17. og 18. århundrede, hvor omfattende uddybning fortsatte ind i det 19. århundrede. Handlen blev styrket i et stykke tid, men i det 20. århundrede havde siltning resulteret i, at floden kun var sejlbar så langt som til Rom selv.
Tiberen var engang kendt for sine oversvømmelser – Campus Martius er en flodslette og ville regelmæssigt oversvømme til en dybde på 2 meter (6 ft 7 in). Floden er nu begrænset mellem høje stenvoller, der blev påbegyndt i 1876. Inden for byen er flodbredderne foret af boulevarder kendt som lungoteveri, gader “langs Tiberen”.
Fordi floden er identificeret med Rom , udtrykkene “svømning i Tiberen” eller “krydsning af Tiberen” er kommet til at være det protestantiske stenografiudtryk for konvertering til romersk katolicisme. Dette er mest almindeligt, hvis den person, der konverterer, havde været anglikaner, hvis omvendte benævnes “svømning af Themsen” eller “krydsning af Themsen”.
I det gamle Rom blev henrettet kriminelle kastet i Tiber. Mennesker henrettet ved trapperne i Gemonian blev kastet i Tiberen under den senere del af kejser Tiberius regeringstid. Denne praksis fortsatte gennem århundrederne. For eksempel blev liget af pave Formosus kastet i Tiberen efter den berygtede kadaversynode, der blev afholdt i 897.