Hesteskokrabber kaldes undertiden “levende fossiler”, fordi de har eksisteret i en eller anden form i mere end 450 millioner år. På denne tid har Jorden gennemgået flere store istider, en stor døende, dannelsen og den efterfølgende nedbrydning af pangaea og en asteroideeffekt, der dræbte dinosaurerne og det meste af livet på jorden endnu en gang. Med andre ord har hesteskokrabber virkelig set noget lort. / p>
Alligevel vil jeg antage, at nogle af deres underligste oplevelser må være kommet i løbet af de sidste par årtier, som en af de bløde kropspattedyr, kom efter dinosaurer begyndte at bruge deres hænder til at øse hesteskokrabber ud af havet i massevis. Moderne mennesker dræber ikke bevidst hesteskoekrabberne – ligesom tidligere århundreder af landmænd, der fangede dem til gødning, eller fiskere, der brugte dem som agn. I stedet skrubber de krabber rene for fuglehorn, fold deres hængslede karapasser og fastgør rustfri ste el nåle ind i et blødt, svagt sted for at trække blod. Hesteskokrabbeblod løber blåt og uigennemsigtigt som frostvæske blandet med mælk.
Og til hvad har mennesker brug for blod fra et levende fossil? En slags trolddom, kan du sige, for det holder bogstaveligt talt folk i live. Hesteskokrabbeblod er udsøgt følsom over for toksiner fra bakterier. Det bruges til at teste for forurening under fremstillingen af alt, hvad der kan gå inde i menneskekroppen: hvert skud, hvert IV-dryp og ethvert implanteret medicinsk udstyr.
Den moderne biomedicinske industri er så afhængig af dette blod, at forsvinden af hesteskokrabber straks ville lamme det. Og i de senere år har hesteskokrabber, især i Asien, været udsat for en række trusler: tab af levesteder, da havmure erstatter strande, hvor de gyder, forurening, overfiskning til brug som mad og agn. Hesteskokrabber blødt til biomedicinsk brug i USA returneres til havet, men anslået 50.000 dør også i processen hvert år.
Der er dog en anden måde – en måde for moderne medicin at gør brug af moderne teknologi snarere end blodet fra et gammelt dyr. En syntetisk erstatning for hestesko-krabbeblod har været tilgængelig i 15 år. Dette er en historie om, hvordan forskere roligt formåede at overgå millioner af år med evolution, og hvorfor det har taget resten af verden så lang tid at indhente.
Flere historier
Jeak Ling Ding siger, at hun “altid var en labrotte” – den slags biolog, der havde hvide frakker på, snarere end den slags, der vassede ind i mudder. Alligevel fandt hun sig i midten af 1980erne til at kvæle gennem mudder på jagt efter hesteskokrabber. flodmundingen, hvor de boede, husker hun på diskret måde, var “slet ikke meget sødt.”
Ding sammen med sin mand og forskning partner Bow Ho, var kommet rundt på hesteskokrabber, og deres ultimative mål var at gøre dyrene ikke længere nødvendige i biomedicinsk forskning. På det tidspunkt var hun molekylærbiolog ved National University of Singapore, og et hospitals in vitro-befrugtningsafdeling var kommet til Ding og Ho med et problem: Deres embryoner ville ikke overleve længe nok – kunne det være på grund af bakteriel kontaminering ?
En standardtest på det tidspunkt – og nu – er LAL, som står for limulus amebocytlysat. Limulus refererer til Limulus polyphemus, arten af hesteskokrabbe, der er hjemmehørende i Nordamerikas atlantiske kyst. Amebocyt refererer til celler i krabbens blod. Og lysat er det materiale, der frigøres fra cellerne, når de først er “lyseret” eller brudt. Dette er de ting, der er meget følsomme over for bakterietoksiner.
Den første person til at finde ud af dette om LAL var Frederik Bang. Tredive år før Ding – og 9.000 miles væk på Cape Cod – indsamlede han også hesteskokrabber på kysten. (Af grunde, der ikke helt forstås, findes hesteskokrabber kun omkring de østlige kyster i Nordamerika og Asien.) Bang, en patolog, var interesseret i skabningens primitive immunsystem. Han besluttede sig for en protokol om injektion af bakterier fra havvand direkte i hesteskokrabber, som får deres blod til at klumpe sammen i “strenge masser.”
Bang mistænkte, at denne koagulation havde et formål. Det immobiliserede bakterierne og forseglede resten af hesteskoens krop fra et invaderende patogen. Spændende blev deres blod til gel, selvom han først kogte bakterieinjektionen i fem eller ti minutter. Dette skulle have dræbt bakterierne og steriliseret den injicerede opløsning. Bang indså, at blodet ikke var følsomt over for levende bakterier, men over for bakterietoksiner, der vedvarer, selv efter sterilisering.
Det menneskelige immunsystem kan være meget mere sofistikeret end hesteskokrabber, men det reagerer også på disse toksiner. Lægerne indså dette først i slutningen af det 19. århundrede, hvor patienter, der fik sterile skud, ikke desto mindre kom ned med “injektionsfeber” eller “saltvandsfeber.” I værste tilfælde kan toksinerne forårsage septisk chok og endda død.
På det tidspunkt, hvor Bang udførte denne forskning i 1950erne, var den standard måde at teste for bakterielle toksiner på at injicere en prøve i kaniner. Det krævede, at nogen kom for at kontrollere kanintemperaturerne hvert 30. minut i tre timer for tegn på feber, hvilket ville antyde bakteriel forurening.
Under mikroskop, havde kaninens blodceller også en tendens til at klumpe sig sammen med toksinet, en lighed, som Bang bemærkede i hans papir fra 1956 om hesteskokrabbeblod. I løbet af det næste halvandet årti udtænkte han og en ung patolog ved navn Jack Levin en standardiseret måde at udtrække LAL på. Det var dog først i 1977, at Food and Drug Administration tillod farmaceutiske virksomheder at erstatte deres store kolonier af kaniner med LAL-sæt. Nu tilføjede du simpelthen LAL til det testede materiale og vendte hætteglasset over for at se, om det blev solidt – meget hurtigere og mere praktisk. LAL-testen krævede stadig brug af dyr, men den uhyggelige proces med at stikke nåle i dyr blev skjult og outsourcet til en anden del af forsyningskæden.
Da Ding ledte efter hesteskokrabber i Singapore , LAL var blevet en millionindustriindustri. En kvart hestesko-krabbeblod er angiveligt værd så meget som $ 15.000. Og de LAL-sæt, hun havde brug for til at teste forurening af IVF-embryoner, var alt for dyre. Et kit, husker hun, kostede $ 1.000 for hende i Singapore.
Derfor overvejede hun at lave sit eget lysat. Men de hestesko-krabber, hun studerede i Singapore, Carcinoscorpius rotundicauda, er meget mindre end atlantiske hesteskokrabber, og de kunne ikke blødes meget uden at dø. Så Ding satte sig for at lave et alternativ til LAL, der i sidste ende slet ikke ville kræve hesteskokrabber.
Hvad det ville kræve var at manipulere DNA. Hendes idé var at splitte hesteskokrabgenet, der er ansvarligt for LALs toksinjagningsevne, i celler, der vokser let i et laboratorium, som gær. Bioteknologi som et felt bevægede sig allerede i retning af rekombinant DNA, hvilket indebærer at tage DNA fra en art og sætte det en anden. Et par år tidligere i 1982 begyndte Eli Lilly at sælge humant insulin dyrket i kar af bakterier.
Ding havde et godt udgangspunkt for sit LAL-alternativ. Dengang havde forskere identificeret faktor C, det specifikke molekyle i LAL, der detekterer bakterielle toksiner. Så hun begyndte at jage efter genet, der fremstiller faktor C. Hendes forskningsteam tog celler fra hesteskokrabber, som de samlede, og blødede dem minimalt. (De forsøgte også, men mislykkedes, at dyrke hesteskokrabber i et laboratorium og opdrætte dem gennem IVF.)
Hesteskokrabbens følsomhed over for bakterietoksiner desværre gjorde det også en smerte at studere. Toksinerne viser sig at være overalt – i vand, i reagensglas, i petriskåle. “Du skal bage alt glas, der kan bages, ved 200 til 220 grader i flere timer.” siger Ding. De måtte også købe specielt vand, der var behandlet for at være fri for bakterietoksin. Hvis du ikke var forsigtig, kunne dit rør af opløsning let blive til gel.
Når Ding og Ho endelig identificerede genet for faktor C, de splejset det i gær. Det mislykkedes, fordi mens gæren producerede faktor C, udskillede det ikke molekylet. “Gæren var meget vanskelig at bryde åben. Det var meget urent og rodet, ”siger hun. De prøvede en anden type gær- og pattedyrceller – de mislykkedes også. I slutningen af 1990erne deltog Ding og Ho på et kursus i USA og lærte om baculovirusvektorsystemer. Her bruges en virus til at indsætte faktor C i insekt tarmceller, hvilket gør dem til små fabrikker til molekylet. Insekter og hestesko har en fælles evolutionær slægt: De er begge leddyr. Og disse celler fungerede vidunderligt.
Endelig halvandet årti efter hun begyndte, havde Ding et alternativ til LAL, der fungerede uden at skade mere hesteskokrabber. Hun coopede sig op i biblioteket for at studere patenter og udarbejdede ansøgningen selv. Derefter sendte hun den af og ventede på, at verden ville ændre sig.
Verden ændrede sig ikke, i det mindste ikke for hesteskokrabberne. Det tog tre år for det første rekombinante faktor C test kit baseret på Dings patent at komme ud i 2003, men selv da viste farmaceutiske virksomheder kun lidt interesse.
Virksomhederne havde en række grunde. Der var kun én leverandør af sættet, en virksomhed, der i dag er en del af det schweiziske baserede kemikaliefirma Lonza. Farmaceutiske virksomheder var forsigtige med at stole på en enkelt kilde til en så vigtig del af deres fremstilling. Hvad hvis der skete noget med Lonza?Eller ramte en naturkatastrofe dets produktionsanlæg? Virksomheder, der bløder krabber, mister også mange penge, hvis faktor C bliver adopteret bredt. Af de seks virksomheder med krabbeblødningsfaciliteter i USA, to afviste interviews, et svarede ikke på en interviewanmodning, og to har stort set ingen offentlig tilstedeværelse. Den sjette er Lonza, som i øjeblikket sælger både LAL og den rekombinante faktor.
Lonza skyldte på sin side den langsomme optagelse af reglerne. I USA fortæller FDA virksomheder, der udfører bakterietoksinprøver, om at følge United States Pharmacopeia, en håndbog, der indeholder lægemiddelstandarder. I en vejledning fra 2012 sagde FDA, at virksomhederne kunne bruge rekombinant faktor C, som ikke vises i Pharmacopeia, hvis de udførte deres egne valideringstest. ”Risikoen er naturligvis, at FDA muligvis ikke accepterer din validering, og du kan ikke bringe dit produkt på markedet,” siger Lonzas talsmand Katrin Hoeck. “Farmaceutiske virksomheder er risikovillige.” Det tog industrien årtier at flytte fra kaniner til LAL også.
Virksomhedens virkelighed blev en reel skuffelse for Ding. ”Vi var bare så ivrige som forskere, så glade for, at det fungerer,” siger hun. „Og vi troede, at den rekombinante faktor C ville blive vedtaget over hele verden, og hesteskokrabben ville blive reddet.”
For nylig har et par ting dog ændret den nylige beregning af risikobelønning for farmaceutiske virksomheder. For det første er Lonza ikke længere den eneste leverandør. I 2013 blev Hyglos det andet firma til at fremstille rekombinant faktor C. Kevin Williams, en seniorforsker hos Hyglos, siger, at han ser som en længe forsinket modernisering: Farmaceutiske virksomheder stoppede med at stole på svin og begyndte at fremstille insulin i gær- og bakterieceller for årtier siden. Hvorfor kan den samme teknologi ikke anvendes til selve testen, der bruges til at kontrollere, at insulin er sikkert til injektion?
På den lovgivningsmæssige side tilføjede den europæiske farmakopé rekombinant faktor C som en accepteret bakterietoksin-test i 2016, der baner vejen for forandring i USA. En række farmaceutiske virksomheder, især Eli Lilly, har sammenlignet effektiviteten af rekombinant faktor C og LAL.
Jay Bolden, en ekspert i bakteriel toksindetektion hos Eli Lilly, minder om Lonza, der kom i deres laboratorier med det rekombinante faktor C-kit for over et årti siden. Han var fascineret på det tidspunkt, men endnu ikke villig til at tage springet. Vendepunktet kom i 2013, da Eli Lilly begyndte at planlægge et insulinfremstillingsanlæg i Kina, hvor de indfødte hestesko-krabberarter er faldet. “Du ville høre ting om en dag, at hesteskokrabben måske blev begrænset,” siger Bolden. I modsætning hertil så forsyningskæden for rekombinant faktor C mere sikker ud med både Hyglos og Lonza som leverandører. LAL og faktor C er også sammenlignelige i omkostninger.
Bolden siger, at Eli Lilly besluttede at “trække en streg i sandet”: Alle nye produkter efter et bestemt tidspunkt ville blive testet med rekombinant faktor C. Virksomheden forelagde for nylig FDA sin første ansøgning om et lægemiddel – galcanezumab til forebyggelse af migræne – hvor det endelige lægemiddel vil blive kvalitetstestet med faktor C. Det har også undersøgt anvendelse af rekombinant faktor C under fremstillingsprocessen til at teste vand og udstyr, som i øjeblikket tegner sig for langt størstedelen af LAL-brugen. Bolden siger, at Eli Lilly har lobbyet US Pharmacopeia for at inkludere rekombinant faktor C.
Torsdag taler Bolden i Cape May, New Jersey, på et arrangement organiseret af Revive & Restore, en nonprofit, der er bedst kendt for sit arbejde med at bringe uddøde arter tilbage til livet. “Vores mission er at bruge bioteknologi til bevarelse,” siger Ryan Phelan, medstifter og administrerende direktør for Revive & Restore. Phelan mødte Ding første gang, da hun rejste til Singapore for en syntetisk -biologiskonference i 2017, og hun indså, at hendes forskning om rekombinant faktor C sad perfekt i krydset mellem bevarelse og bioteknologi.
Revive & Restore og dets bevaringspartnere – New Jersey Audubon, American Littoral Society og Delaware River Keeper Network – valgte Cape May-placeringen, fordi hesteskokrabber kommer her hvert forår for at gyte. Du kan ikke længere fange hestesko krabber her på grund af deres betydning for en truet trækfugleart kaldet den røde knude. Disse fugle dukker også op her om foråret. Deres vandring er tidsindstillet, så fugle, der flyver fra Sydamerika til Arktis, kan sluge sig på kaviarlignende hestesko-krabbeæg Strandene bliver sorte af krabber, deres hun Det klikker i klap, når hunner klatrer for at lægge deres æg og hanner for at befrugte dem.De røde knuder krypterer for at spise. De fordobles næsten i vægt for deres rejse til Arktis.
Det er en gammel synkronisering mellem arter, der begyndte længe før mennesker begyndte at høste hesteskokrabber efter blod og vil forhåbentlig vare længe efter.