ORIGINAL ARTIKLER ARTIGOS ORIGINALIS

Bioelektrisk impedansanalyse og antropometri til bestemmelse af kropssammensætning hos rotter: virkninger af diæt med højt fedtindhold og høj saccharose

Elektrisk bioimpedans og antropometri til bestemmelse af kropssammensætning af rotter: virkninger af diæt rig på lipider og saccharose

Larissa Rodrigues Neto AngélocoI; Rafael Deminice, II; Izabel de Arruda LemeI; Renata Cristina LataroI; Alceu Afonso JordãoI

IUniversity of São Paulo, Det Medicinske Fakultet i Ribeirão Preto, Laboratory of Nutrition and Metabolism. Av. Bandeirantes, 3900, 14049-900, Ribeirão Preto, SP, Brasilien. Korrespondance til / Korrespondance til: AA JORDÃO. E-mail: < [email protected] >
II Universitetet i Londrina, Fakultet for Fysisk Uddannelse og Sport, Institut for fysisk træning. Londrina, PR, Brasilien

SAMMENFATNING

MÅL: Målet med denne undersøgelse var at bestemme impedansen hos Wistar-rotter behandlet med fedtfattig og højsukkerøs diæt og korrelere deres biokemiske og antropometriske parametre med kemisk analyse af slagtekroppen.
METODER: Fireogtyve Wistar-hanrotter blev fodret med en standard (AIN-93), fedtfattig (50% fedt) eller høj-saccharose (59% af saccharose) diæt i 4 uger. Abdominal og thorax omkreds og kropslængde blev målt. Bioelektrisk impedansanalyse blev anvendt til at bestemme modstand og reaktans. Den endelige kropssammensætning blev bestemt ved kemisk analyse.
RESULTATER: Højere fedtindtag førte til en høj procentdel af leverfedt og kolesterol og lavt total kropsvand i gruppen med højt fedtindhold, men disse ændringer i den biokemiske profil blev ikke reflekteret af de antropometriske målinger eller bioelektriske impedansanalysevariabler. Ændringer i antropometrisk og bioelektrisk impedans blev ikke observeret i gruppen med høj saccharose. Imidlertid blev der fundet en positiv sammenhæng mellem kropsfedt og tre antropometriske variabler: kropsmasseindeks, Lee-indeks og abdominal omkreds.
KONKLUSION: Bioelektrisk impedansanalyse viste sig ikke at være følsom til at detektere ændringer i kropssammensætning, men kropsmasseindeks, Lee-indeks og abdominal omkreds kan bruges til at estimere kroppens sammensætning af rotter.

Indeksering termer: Antropometri. Bioelektrisk impedansanalyse. Kost. Rotter.

ABSTRAKT

MÅL: At bestemme impedansen hos rotter behandlet med diæter rig på lipider og saccharose ved hjælp af den elektriske bioimpedansmetode og korrelere med den direkte analyse af slagtekroppen, biokemiske parametre og antropometrisk .
METODER: Der blev anvendt 24 hanrotter (Wistar), som blev fodret med en standard diæt, rig på lipider eller rig på saccharose i 4 uger. Kontrolgruppen modtog AIN-93 standard diæt; den hyperlipide diæt indeholdende 50% lipider, hvoraf 70% var mættet fedt; og den saccharose-rige gruppe blev fodret med en højere andel af enkle kulhydrater uden ændring i den samlede mængde.
RESULTATER: Det højere indtag af lipider førte til en stigning i procentdelen af leverfedt og kolesterol og reducerede mængden af total kropsvand i den hyperlipidiske gruppe, men disse ændringer i den biokemiske profil blev ikke afspejlet i antropometriske ændringer eller ændringer i parametre elektrisk bioimpedans. Ændringer i antropometri og elektrisk bioimpedans blev ikke observeret i den saccharose-rige gruppe. Der blev dog observeret en positiv sammenhæng mellem kropsfedt og tre antropometriske parametre, det vil sige kropsmasseindeks, Lee-indeks og abdominal omkreds.
KONKLUSION: Bioelektrisk impedans var ikke følsom til at detektere ændringer i sammensætning Det blev dog observeret, at antropometrisk parametre – kropsmasseindeks, Lee-indeks og maveomkreds – kan bruges til at estimere kropssammensætning hos rotter.

Indeksudtryk: Antropometri. Elektrisk bioimpedans. Kost. Mus.

INTRODUKTION

Kropssammensætning vurderes normalt til bestemmelse af mangler eller overdreven kropskomponent, såsom magert masse og fedtmasse, som muliggør en forståelse af ernæringsstatus1. Den store betydning af denne vurdering er, at kropsvægt alene ikke afspejler, om der er for meget eller for lidt af disse kropskomponenter, hvilket kan være farligt2. Derudover kan ændringer i kropssammensætning have en indvirkning på stofskiftet, da fedtvæv modulerer lipid og glukose-homeostase3.

Nøjagtige metoder til bestemmelse af dyrs kropssammensætning er yderst vigtige for at forstå, hvordan kroppen reagerer på næringsstofindtag, og for ernæringsmæssige og fysiologiske undersøgelser4,5, der bruger dyremodeller til at undersøge virkningerne af fedme og næringsstofmangel6 , 7.

Direkte kemisk analyse af slagtekroppen er referencemetoden til bestemmelse af rottekropssammensætning8. Men selvom direkte kemisk analyse giver mere præcis information, er den invasiv, tidskrævende, dyr og kræver teknisk viden. Det kan heller ikke bruges til levende dyr1, så dets anvendelse er begrænset.

I et forsøg på at overvinde ulemperne ved direkte kemisk analyse af slagtekroppen er der anvendt indirekte teknikker til bestemmelse af dyrs kropssammensætning8. Interessen for bioelektrisk impedans (BIA) er steget for nylig, da det er en ikke-invasiv, billig, hurtig og reproducerbar metode9, der giver et godt skøn over kropssammensætning10. Desuden kan det bruges gentagne gange på det samme dyr, hvilket forårsager minimal forstyrrelse1,11. Estimationsnøjagtighed vil dog afhænge af den anvendte ligning og standardisering af testbetingelserne12.

Da bioelektrisk impedans er baseret på princippet om, at væv har forskellige impedanser, dvs. modstand mod strømmen af en elektrisk strøm, som igen er afhængig af vand- og elektrolytindhold, 13 og forudsat at den fedtfrie masse har et konstant vandindhold og resistivitet, kan total kropsvand (TBW) og fedtfri masse (FFM) estimeres ved at måle den elektriske impedans af kroppen14.

Undersøgelser, der overvejer disse oplysninger til brug af BIA hos dyr, har vist, at BIA kan bruges til at forudsige dyrets samlede kropsvand, men der er ingen specifikke formler, der adskiller magert fra fedtmasse1 11,15. Derudover har få studier brugt denne metode hos rotter, og ingen undersøgelser har undersøgt, om diæt påvirker kropssammensætningen, og om BIA er i stand til at detektere subtile ændringer.

Flere undersøgelser, der bruger BIA på levende dyr, er nødvendige for at bestemme, om denne teknik kan bestemme rotters “kropssammensætning nøjagtigt, og hvis diæt påvirker forsøgsdyrenes kropssammensætning.

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme impedansen hos Wistar-rotter, der fodres med fedtfattige og højsukkarose-diæter af BIA og for at kontrollere, om resultaterne stemmer overens med resultaterne opnået ved direkte kemisk analyse af slagtekroppen og biokemiske og antropometriske målinger.

METODER

Dyr og behandling

Undersøgelsen omfattede 24 Wistar-hanrotter med en indledende gennemsnitsvægt på 65 g opnået fra det centrale dyrefacilitet ved Ribeirão Preto School of Medicine, Universidade de São Paulo (FMRP / USP). Projektet blev godkendt af FMRP / USP Ethics Committee on Animal Research, protoc ol nummer 147/2008. Dyrene blev anbragt i individuelle bure under en skiftevis 12-timers lys / mørk cyklus, gennemsnitstemperatur på 22 ° C og fri adgang til mad og vand.

Kontrolgruppen fik standard AIN-93 diæt16, og gruppen med højt fedtindhold fik en HF-diæt indeholdende 15% fedt, tilpasset fra Reeves et al.16, som beskrevet i tabel 117. Fedt i kontrol-dietten stammer udelukkende fra sojabønneolie og i HF-diæt fra gengivet svinefedt (70,00%) og sojaolie (30,00%). HS diæten havde en anden kulhydrat sammensætning, det vil sige mere enkle kulhydrater: mens kontrol diæten hovedsageligt indeholdt majsstivelse, indeholdt HS dietten 3,50% majsstivelse og 59,85% saccharose18 (tabel 1).

Dyrene var vejes en gang om ugen med en Filizola® elektronisk skala med en kapacitet på 1.500 gram og en nøjagtighed på 1 gram. Fødeindtag blev overvåget ved at veje foderautomaterne tre gange om ugen i løbet af undersøgelsesperioden.

Ved afslutningen af 4-ugers intervention blev dyrenes kropsimpedans målt ved BIA, og dyrene blev ofret ved halshugning. Leveren og blodet blev opsamlet, serumet blev adskilt, og alle genstande blev straks frosset indtil brug. Resten af dyrene blev også frosset indtil direkte kemisk analyse af slagtekroppen.

Antropometriske målinger

Kropslængde blev målt fra næseboret til bunden af halen (bækken-kaudal knudepunkt), abdominal omkreds ved det punkt umiddelbart fortil forfoden og bryst omkreds på stedet umiddelbart bag forbenet19. Rotterne blev bedøvet med 2 % tribromoethanol til målingerne.

Et ikke-elastisk målebånd blev anvendt til alle målinger.

BMI blev bestemt ved at dividere dyrets vægt (g) med kvadratet af dets længde (cm). Lee-indekset blev bestemt ved at dividere terningen af kropsvægten (g) med næsens anuslængde (cm) 20.

Bioelektrisk impedans

Helkroppsresistens ( WBR) og reaktans (WBXc) blev målt ved hjælp af en fasesensitiv tetrapolær bioelektrisk impedansanalysator (Byodinamics BIA 310E). Standard hypodermiske nåle blev brugt som elektroder.Rotterne blev bedøvet og anbragt på deres mave på en ikke-ledende overflade for at eliminere interferens fra elektrisk induktion. Dorsale overflader på hovedet og kroppen blev barberet til placering af nålelektroderne. Kildeelektrode 1 blev anbragt på midterlinjen på kredsløbets forreste kant, og kildeelektrode 2 blev anbragt 4 cm fra halebasen. Detektorelektrode 1 blev placeret på den forreste åbning af øret, og detektorelektrode 2 blev anbragt i midterområdet af bækkenet1. Alle impedansmålinger blev udført i godt fodrede og hydratiserede dyr.

Laboratoriemetoder

Biokemiske analyser

Leverfedt blev bestemt som foreslået af Bligh & Dyer21. Totalt serumkolesterol og protein og blodglukose blev bestemt ved kolorimetriske reaktioner under anvendelse af LABTEST®-enzymsættet.

Direkte kemisk analyse af slagtekroppen

I slutningen af de fire uger ved intervention blev dyrene aflivet ved halshugning og frosset indtil kemisk analyse af slagtekroppen. Hud, indvolde, hoved og fødder blev kasseret ved kun at bruge knogler og muskler til kvantitativ analyse af vand, fedt og protein22. Vandindholdet blev bestemt ved at placere de tomme kroppe individuelt i aluminiumsark i en ovn ved 105 ° C i 24 timer. Mængden af vand, der er til stede i slagtekroppen, blev beregnet ved at fratrække den tørre slagtekropsvægt fra baseline-slagtekroppens vægt. De tørre slagtekroppe blev derefter masereret, og fedtet blev ekstraheret ved intermitterende ekstraktion under anvendelse af petroleumsether og en Soxhlet-ekstraktor. Kropsfedt blev beregnet ved hjælp af forskellen i vægt. Proteinindholdet blev beregnet ved hjælp af mikro-Kjeldahl-metoden23, en indirekte nitrogenbestemmelsesmetode ved anvendelse af 6,25-faktoren til omdannelse til protein. Alle analyser blev gentaget tre gange på FMRP / USP Nutrition and Metabolism Laboratory.

Statistisk analyse

Data udtrykkes som middel (M) og standardafvigelse (SD). Analyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukey post-hoc test blev brugt til at undersøge mulige forskelle i undersøgelsesparametrene og lineær regression til at undersøge mulige korrelationer mellem undersøgelsesvariablerne. Signifikansniveauet blev sat til 5% (p < 0,05) for alle analyser.

RESULTATER

Tabel 2 viser vægten og maden indtagelse af grupperne. HF-gruppen indtog signifikant mindre mad (g / uge) end gruppe C og HS, men grupperne adskilte sig ikke med hensyn til energiindtag (kcal / uge). Alle dyr havde lignende basislinje- og slutvægte og vægtøgning under interventionen.

HF-gruppen havde signifikant højere hepatisk fedtindhold og serumcholesterolniveau end gruppe C. I mellemtiden havde HS-gruppen signifikant højere blodglukoseniveau end HF-gruppen. Gruppe HF havde signifikant mindre totalt protein end gruppe C og HS.

Tabel 3 viser omkredsen, BMI og Lee-indekset for dyrene. Disse variabler adskilte sig ikke signifikant blandt grupperne, og heller ikke resistens eller reaktans. Tabel 4.

Tabel 5 viser sammensætningen af slagtekroppene bestemt ved direkte kemisk analyse. Kun TBW og protein adskilte sig signifikant blandt grupperne (p < 0,05): de var lavere i HF-gruppen end i C- og HS-grupperne.

Figur 1 viser de positive sammenhænge, der findes mellem kropsfedt og BMI, Lee-indeks og abdominal omkreds. En negativ korrelation (p <

DISKUSSION

Virkningerne af forskellige makronæringsindtag er blevet grundigt undersøgt hos forsøgsdyr. Der er dog kun få oplysninger om effekten af forskellige makronæringsindtag på kropssammensætningen og antropometriske variabler hos gnavere generelt. Der er heller ikke meget kendt om gyldigheden af disse metoder til den antropometriske vurdering af disse dyr.

Der er adskillige eksperimentelle undersøgelser, der undersøger virkningerne af diæt med højt fedtindhold og højt saccharoseindhold på rotter, da disse diæter fremmer metabolisk ændringer, men de vurderer normalt kun deres virkning på kropsvægt24-26. BIA kan nøjagtigt måle magert og fedtmasse, og denne skelnen er vigtig, fordi overskydende kropsfedt kompromitterer sundheden og kan fremme udviklingen af glukoseintolerance og dyslipidæmi. Det er vigtigt, at BIA kan bruges gentagne gange til bestemmelse af kropssammensætningen af levende dyr, mens direkte kemisk analyse kræver ofring.

I dette eksperiment korrelerede abdominal omkreds, Lee-indeks og BMI (figur 1) signifikant med kroppen sammensætning. Den positive sammenhæng fundet mellem kropsfedt og BMI er i overensstemmelse med Novelli et al.19, der foreslog, at BMI pålideligt kan estimere kropsfedt hos rotter, selvom det ikke er følsomt nok til at detektere kropsændringer, der stammer fra diæter med forskellige makronæringsstoffer. I modsætning til det nuværende eksperiment viste den citerede undersøgelse ikke data vedrørende sammenhængen mellem kropsfedt og Lee-indekset og abdominal omkreds. Således bør fremtidige undersøgelser undersøge, hvor nøjagtigt disse variabler kan afspejle ændringer i kropssammensætningen.

Bioelektrisk impedans bruges til mennesker som en hurtig, ikke-invasiv og reproducerbar metode til bestemmelse af kropssammensætning og vandindhold27,28. Imidlertid har få undersøgelser brugt denne teknik hos forsøgsdyr11,29,30, så denne metode skal undersøges nærmere.

Overraskende nok viste de nuværende resultater, at resistensdata ikke korrelerer med kropsfedt bestemt kemisk, hvilket antyder, at BIA ikke er tilstrækkelig følsom til at måle kroppens sammensætning af rotter eller detektere forskellene i grupper, der modtager forskellige diæter. En anden uenighed vedrørte reaktans, som var negativt korreleret med kropsfedt, i modsætning til Hall et al. 1, hvor reaktans sammenlignet med modstand ikke blev betragtet som en stærk forudsigelse for nogen kropskomponent. Denne undersøgelse fandt også bred variation inden for gruppen, der viser heterogeniteten af disse dyr og deres forskellige reaktioner på den samme diæt.

I modsætning til de nuværende resultater har andre undersøgelser vist, at BIA er tilstrækkelig følsom til at bestemme rottekroppen sammensætning. I en banebrydende undersøgelse udviklede Hall et al. 1 en passende metode til brug af BIA hos rotter og fandt en stærk negativ sammenhæng mellem Whole Body Resistance (WBR) målt ved 50 kHz og total kropsvand og protein. Yoki et al.31 anvendte den empiriske formel foreslået af Hall et al.1 til at estimere det samlede legemsvand fra rotter, der fik en kontroldiæt og en diæt suppleret med methionin eller homocystein, og demonstrerede, at denne formel var i stand til at påvise forskelle mellem grupperne . I modsætning til den nuværende undersøgelse var der ingen sammenhænge mellem denne formel og kropssammensætningsvariabler. Der var heller ingen forskelle mellem grupper, der fik forskellige diæter. Rutter et al.11 bemærkede, at BIA kunne bruges til at estimere det samlede legemsvand af kontrolrotter, skønt metoden var mindre nøjagtig, når proceduren blev anvendt hos rotter, der fik en fedtfattig diæt.

Den nuværende Resultaterne viser, at fedtindtagelsen i HF-gruppen og saccharoseindtagelsen i HS-gruppen var betydeligt højere (HF: 389% og HS: 512%) end i kontrolgruppen i interventionsperioden, på trods af lavere madindtag og samme energi indtag. Rottetendens til at forbruge mindre fedtfattig mad bekræftes af andre undersøgelser32,33. Denne ændring i madindtag kan skyldes en mekanisme hos rotter, der regulerer madindtag, hvilket reducerer madindtag, når kosten er energitæt34.

Men højere fedtindtag øger leverfedt og kolesterol og reducerer den samlede krop vand, hvilket viser, at fedtfattige diæter ændrer dyrenes lipidprofil. Ikke desto mindre blev disse ændringer i blodbiokemi ikke afspejlet af antropometriske eller BIA-variabler, hvilket er uenig med de fleste litteraturrapporter11,29. Det er således muligt, at varigheden af undersøgelsesinterventionen ikke var tilstrækkelig til at ændre kropssammensætning, men nok til at ændre den biokemiske profil, da den ændres lettere, eller at en diæt med forskellige fedtandele ville være nødvendig. Nogle undersøgelser har også vist, at høj fedtophobning hos rotter ikke afhænger af dyrenes alder eller køn, selvom genetik kan påvirke fedtretention35. BIA-standardisering hos rotter med udvikling af mindre enheder og specifikke ligninger kunne give mere nøjagtige resultater.

KONKLUSION

Som konklusion var BIA ikke i stand til at detektere ændringer i kropssammensætningen hos rotter, der blev fodret højt -fedt og høj-sukrose diæter. Kropsfedt var imidlertid signifikant forbundet med BMI, Lee-indeks og abdominal omkreds, hvilket antyder, at disse parametre kan anvendes til estimering af rottekropssammensætning. Mere forskning er nødvendig ved hjælp af BIA til at vurdere kropsfedtet hos dyr, der fodres med forskellige diæter. Sammenhængen mellem diæt og kropssammensætning, og hvordan kropssammensætningen ændrer sig over tid, kunne undersøges uden at skulle dræbe dyrene.

ANKENDELSE

Denne undersøgelse blev sponsoreret af Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (tilskudsnummer 2008 / 11704-0).

BIDRAG

LRN ANGÉLOCO og R DEMINICE planlagde og gennemførte eksperimentet, analyserede data og skrev manuskriptet. IA LEME hjalp med at udføre eksperimentet, standardiserede BIA hos rotter, analyserede data og skrev manuskriptet. RC LATARO hjalp med at udføre eksperimentet, indsamlede laboratoriedata og analyserede dataene. AA JORDÃO hjalp med til at planlægge eksperimentet, analyserede data og skrev manuskriptet.

1. Hall CB, Lukaski HC, Marchello MJ.Skøn over rottekropssammensætning ved anvendelse af tetrapolar bioelektrisk impedansanalyse. Nutri Rep Int. 1989; 39 (3): 627-33.

6. Hariri N, Thibault L. Fedtfattig diætinduceret fedme i dyremodeller. Nutr Res Rev.2010; 23 (2): 270-99.

8. Trocki O, Baer DJ, Castonguay TW. En evaluering af brugen af total kropselektrisk ledningsevne til estimering af kropssammensætning hos voksne rotter: virkning af diæt fedme og adrenalektomi. Physiol opfører sig. 1995; 57 (4): 765-72.

12. National Institutes of Health. Bioelektrisk impedansanalyse i måling af kropssammensætning: National Institutes of Health Technology Assessment Conference Statement. Am J Clin Nutr. 1996; 64 (3): 524S-32S.

14. Afdeling LC, Doman D, Jebb SA. Evaluering af et nyt bioelektrisk impedansinstrument til forudsigelse af kropscellemasse uafhængigt af højde eller vægt. Ernæring. 2000; 16 (9): 745-50.

16. Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC. AIN-93 oprensede kostvaner til laboratoriegnavere: slutrapport fra American Institute of Nutrition ad hoc skrivekomité om omformulering af AIN-76A gnavere diæt. J Nutr. 1993; 123 (11): 1939-51.

17. Sabbatini AB, Penati A C, Santos RDS, Tostes LM, Vieira LC, Lamas J. Efeitos de uma dieta hiperlipídica em ratos Wistar. Anais do 14º Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP, 2006; Ribeirão Preto.

18. Castro GSF, Almeida LP, Vannucchi H, Portari GV, Jordao AA. Virkninger af diæter, der indeholder forskellige typer kulhydrater på levermetabolisme. Scand J Lab Anim Sci. 2008; 35 (4): 321-28.

20. Bernardis LL, Patterson BD. Korrelation mellem “Lee-indeks” og kropsfedtindhold hos fravænne og voksne hunrotter med hypothalamiske læsioner. J Endocrinol. 1968; 40 (4): 527-8.

22. Franco FSC, Natali AJ, Costa NMB, Lunz W, Gomes GJ, Carneiro Junior MA, et al. Virkninger af kreatintilskud og styrketræning på ydeevne og magert kropsmasse hos rotter. Præst Bras Med Esporte. 2007; 13 (5): 297-302.

24. Castro GSF, Almeida BB, Leonardi DS, Ovídio PP, Jordão AA. Forbindelse mellem levercholesterol og oliesyre i leveren hos rotter behandlet med delvist hydrogeneret vegetabilsk olie. Rev Nutr. 2012; 25 (1): 45-56. doi: 10.1590 / S1415-52732012 000100005.

26. Liu SH, He SP, Chiang MT. Virkninger af langvarig fodring af chitosan på postprandial lipidrespons og lipidmetabolisme i en glukosetolerant rotte-model med høj saccharose-diæt. J Agric Food Chem. 2012; 60 (17): 4306-13.

29. Ilagan J, Bhutani V, Archer P, Lin PK, Jen KL. Estimering af kropssammensætningsændringer under vægtcykling ved bioelektrisk impedansanalyse hos rotter. J Appl Physiol. 1993; 75 (5): 2092-8.

30. Cornish BH, Ward LC, Thomas BJ. Måling af ekstracellulært og totalt legemsvand fra rotter ved anvendelse af bioelektrisk impedansanalyse med flere frekvenser. Nutr Res. 1992; 12 (4-5): 657-66.

31. Yokoi K, Lukaski HC, Uthus EO, Nielsen FH. Anvendelse af bioimpedansspektroskopi til estimering af kropsvandsfordeling hos rotter, der fodres med svovlholdige aminosyrer. J Nutr. 2001; 131 (4): 1302-8.

32. Estrany ME, Proenza AM, Lladó I, Gianotti M. Isokalorisk indtagelse af en fedtfattig diæt ændrer fedme og lipidhåndtering på en kønsafhængig måde hos rotter. Lipider Health Dis. 2011; 12: 10-52.

33. Nakashima Y, Yokokura A. Forbrug af en fedtfattig diæt, der indeholder svinefedt i vækstperioden hos rotter, disponerer dem for at reagere positivt på kosten senere i livet. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2010; 56 (6): 380-6.

35. Ellis J, Lake A, Hoover-Plough J. Enumættet rapsolie reducerer fedtaflejring hos voksende hunrotter, der får en diæt med højt eller lavt fedtindhold. Nutr Res. 2002; 22: 609-21.