Antinficerende Ophiocordyceps-genomer afslører en stor mangfoldighed af potentielle adfærdsmanipulationsgener og en mulig vigtig rolle for enterotoksiner

Genomfunktioner

Ophiocordyceps-udkastgenomer genereret i denne undersøgelse (Tabel 1) blev samlet med læsninger genereret på tværs af forskellige sekventeringskørsler under anvendelse af to typer DNA-biblioteker. Kun de kørsler, der førte til aflæsninger af høj kvalitet, blev brugt til samling (se Materialer og metoder). Contig-samling resulterede i genomstørrelser fra 21,91-23,92 millioner basepar (Mbp) for O. unilateralis s.l. og O. australis s.l. arter. I modsætning hertil er O. subramanianii s.l. havde en estimeret genomstørrelse på 32,31 Mb. Genforudsigelse gav mellem 7.621 og 8.629 gener for O. unilateralis- og O. australis-arten. Ophiocordyceps subramanianii s.l. blev forudsagt at have 11.275 gener. Derudover er GC-indhold i O. subramanianii s.l. (dvs. 60,35%) var meget højere sammenlignet med de andre Ophiocordyceps-arter i denne undersøgelse (54,66% + / – 1,57%) (tabel 1).

Vi forbedrede også samlingen og genforudsigelsen af det tidligere publicerede genom af O. unilateralis sl stamme SC16a (supplerende tabel S1), som nu har modtaget artsnavnet O. kimflemingiae 20. Ud over at være mindre fragmenteret er den nye samling mindre end tidligere rapporteret18. Dette skyldes sandsynligvis en bedre samling af gentagne regioner, som blev fundet højest i unilateralis-arten (6,59-6,83%) sammenlignet med de andre ant-inficerende arter i denne undersøgelse (tabel 1). På trods af den mindre forsamlingsstørrelse øgede den nye genforudsigelse gentællingen med 798 gener. Denne stigning er overvejende forårsaget af forudsigelsen af færre kimærer (dvs. nærliggende gener, der er fejlagtigt flettet i en genmodel) ved hjælp af Braker1-pipelinen (data ikke vist).

For alle undtagen en af de gener, der genereres i denne undersøgelse blev genforudsigelse informeret af RNA-Seq-læsninger. For de tidligere rapporterede nordamerikanske unilateralis-arter O. kimflemingiae blev læsninger genereret i den tidligere undersøgelse brugt18. Gennem vanskeligheder med dyrkning af brasiliansk O. camponoti-rufipedis blev der ikke opnået nok materiale til at generere RNA-Seq-data ud over de DNA-aflæsninger, der var nødvendige for at opnå et udkast genom. Fordi både O. kimflemingiae og O. camponoti-rufipedis opholder sig inden for det samme artskompleks (unilateralis), forsøgte vi at kortlægge de nordamerikanske unilateralis-arter, der læses til O. camponoti-rufipedis-genomet for at se, om de kunne bruges til at informere kommentar. Mens 93% af O. kimflemingiae læser kortlagt til sit eget genom, er kun 43% kortlagt til O. camponoti-rufipedis genomet (supplerende tabel S2). Vi kortlagde desuden læsningerne til en anden offentliggjort O. unilateralis s.l. genom, det fra O. polyrhachis-furcata 22, for at bestemme, om dette ville være en mere generel krydskortningseffekt eller specifik for O. camponoti-rufipedis genomet. En tilsvarende kortlægning på 41% resulterede. Dette antyder, at unilateralis-arter generelt kan være ret fjernt beslægtede, hvilket gør krydskortlægning for at informere kommentar mindre passende. Til informative formål krydskortede vi også australis-arten med hinanden (stammer MAP-64 fra Brasilien og 1348a fra Ghana). Dette resulterede i 71% og 82% krydskortede læsninger versus henholdsvis 86% og 97% kortlagt til deres egne genomer (Supplerende tabel S2). Dette indebærer, at arter i australis-komplekset således sandsynligvis er meget tættere forbundet med hinanden end arter inden for unilateralis-komplekset.

Ortologiske klynger

Vi satte os for at undersøge hvilke genforudsigelser af de antinficerende Ophiocordyceps-arter i denne undersøgelse er sandsynligvis konserverede og deles med andre ascomyceter. Derudover tilstræbte vi at finde ud af, hvilke artsspecifikke og “manipulationsspecifikke” specialiseringer der kunne have fundet sted. Som sådan blev de forudsagte proteomer fra vores fem antinficerende svampe sammenlignet med 18 andre ascomycetøse svampe. Af disse arter var ti var dyreparasitter (to inficerende pattedyr, to inficerende nematoder og seks inficerende insekter) og 13 bor i samme rækkefølge (Hypocreales). Fire arter tilhørte den samme familie (Ophiocordycipitaceae), og to var inden for samme slægt (Ophiocordyceps). fylogenetisk rekonstruktion baseret på 67 konserverede gener til stede i hver af disse organismer er afbildet i fig. 2.

I alt 51.012 orthologe klynger inkluderede alle annoterede proteiner af hver af de 23 ascomyceter inkluderet i denne analyse (Supplerende data S1). Resuméstatistikker vedrørende denne klyngedannelse kan findes i supplerende figur S1. Vi sammenlignede overlapning af ortologe klynger mellem tre artsintervaller: 1) de antinficerende svampe, der omfattede alle fem trækgenomer genereret i denne undersøgelse, 2) de andre insektinficerende svampe Ophiocordyceps sinensis, Tolypocladium inflatum, både Metarhizium og begge Cordyceps-arter og 3) alle ikke-insektinficerende ascomyceter, som omfattede andre dyreinficerende, planteinficerende, svampeinficerende og saprofytiske svampe. Resultaterne af denne analyse er afbildet i Venn-diagrammet i fig. 3a. Derefter udførte vi berigelsesanalyser for de funktionelle annoteringer af antinficerende artsgener, der blev fundet inden for de forskellige overlappende og ikke-overlappende dele af diagrammet. Af de 7.931 ortologiske klynger, der blev fundet inden for alle tre artsområder, var Gene Ontology (GO) -kommentarer for generelle biologiske processer signifikant overrepræsenteret. Dette antyder, som man kunne forvente, at ascomycetes med forskellige livsstiler bruger lignende mekanismer til generelle processer såsom transkription, translation, proteintransport og signaltransduktion. Imidlertid var gener forudsagt til at kode for (små) udskilte proteiner, proteiner med GO-kommentarer til multiorganismeprocesser og patogenese og mere specifikt secernerede formodede enterotoksiner var underrepræsenteret. Faktisk, da vi udførte en berigelsesanalyse af annotationer til stede i ortologe klynger, der kun blev fundet i den antinficerende art (dvs. 6.672 klynger, fig. 3a), fandt vi det modsatte resultat. GO-annoteringer for (stort set de samme) generelle biologiske processer var signifikant underrepræsenteret, mens (små) secernerede proteiner, proteiner med GO-kommentarer for multi-organisme-processer og patogenese, og formodede enterotoksiner var overrepræsenteret. Dette antyder, at en væsentlig del af hemmeligheden for de antinficerende svampe i denne undersøgelse er specifik for dem. Denne specificitet optrådte dels på grund af enterotoksiner, der er en del af de secernome og bioaktive små secernerede proteiner (SSPer), der kunne være vigtige i svamp-myre-interaktioner. (Små) udskilte proteiner var også overrepræsenteret blandt de klynger, som antinficerende svampe udelukkende delte enten med andre entomopatogener (262 klynger) eller ikke-entomopatogener (449 klynger). Dette indikerer, at deres sekretomer også indeholder mere generelle entomopathogen-specifikke proteiner såvel som proteiner, der udelukkende deles med ikke-entomopatogene ascomycetes.

Vi undersøgte også, hvordan ortologiske klynger, der kun blev fundet blandt de antinficerende svampe, var repræsenteret af disse arter (fig. 3b). Af de samlede 6.672 klynger i denne sammenligning syntes 90,6% at være artsspecifikke. Klyngens overlapning var således marginal, selvom alle arter i denne undersøgelse opholder sig inden for den samme slægt (Ophiocordyceps) og i nogle tilfælde endda inden for det samme artskompleks (O. unilateralis s.l. og O. australis s.l.). Analysering af berigelse af funktionelle annotationsudtryk i disse artsspecifikke klynger resulterede igen i overrepræsentationer af (små) udskilte proteiner. Selvom det var marginalt, blev de fleste klyngeoverlappinger fundet mellem tættere beslægtede arter inden for det samme kompleks (dvs. O. australis s.l., 289 klynger og O. unilateralis s.l., 182 klynger Fig. 3b). Også her afslørede berigelsesanalyser en overrepræsentation for (små) udskilte proteiner. Det ser således ud til, at en statistisk signifikant mængde af svampesekretomet for disse antinficerende arter enten er kompleks eller artsspecifik. Derudover fandt vi en overrepræsentation af patogenicitets-GO-termer blandt de kompleksspecifikke ortologiske klynger. Dette fund kunne tilskrives tilstedeværelsen af ortologiske enterotoksiner i arter inden for det samme kompleks.Kun fire klynger, der ikke var til stede i nogen af de andre ascomycetes i vores sammenligning, blev delt mellem alle fem ant-inficerende arter (fig. 3b). Ingen af disse fire klynger modtog en funktionel kommentar, men tre af dem indeholdt gener med forudsagte sekretionssignaler. For tre ud af de fire klynger resulterede en BLASTp-analyse af generne mod NCBI-databasen udelukkende i hypotetiske proteintreff med den tidligere deponerede version af O. kimflemingiae genomet18. Dette indikerer, at disse klynger faktisk kan repræsentere proteiner, der er unikke for antinficerende Ophiocordyceps-arter. Proteinsekvenser inden for den fjerde klynge resulterede i hits med metalloproteaser ud over at tilpasse sig igen med et hypotetisk protein fra O. kimflemingiae (XA68_3159), (supplerende tabel S3). Denne klynge kan således indeholde formodede metalloproteaser, der udelukkende findes i genomerne fra den antinficerende svampeart, der er undersøgt her. Desuden blev kun 2 af de klynger, der findes entydigt i de antinficerende svampe, delt mellem alle fire arter, der inducerer bideadfærd (fig. 3b). En BLASTp-analyse af generne i disse klynger resulterede igen i hypotetiske proteintreff med den tidligere deponerede version af O. kimflemingiae genomet18 (supplerende tabel S4).

Kandidatmanipulationsgener involveret i etablering af bidende adfærd

Vi analyserede bevarelsen af kandidatgener associeret med den manipulerede bidende begivenhed observeret i inficerede myrer. Vi brugte tidligere offentliggjorte transkriptomiske data18 og genbestemte differentiel genekspression ved at kortlægge dataene til den nye version af O. kimflemingiae genomet. I henhold til den tidligere offentliggjorte undersøgelse fulgte vi ræsonnementet om, at kandidatgener, der var involveret i etablering af manipuleret bidende adfærd, ville blive opreguleret under denne begivenhed og hurtigt nedreguleret igen efter. Som sådan blev 547 kandidatgener identificeret, hvilket er 49 mere end rapporteret i den foregående analyse18. I tråd med de tidligere rapporterede data var gener involveret i DNA-replikation, oxidationsreduktionsprocesser, sekretion og sekundær metabolisme overrepræsenteret.

Konservering af kandidatmanipulationsgener blev også analyseret ved hjælp af ortolog klyngedannelse. Vi sammenlignede overlapning af ortologiske klynger indeholdende de kandidatgener, der var signifikant op- under og nedreguleret efter manipuleret bidende adfærd i O. kimflemingiae, med tre artsområder: 1) de andre antinficerende svampe, som omfattede de fire nye udkast genomer genereret i denne undersøgelse, 2) de andre insektinficerende svampe og 3) alle ikke-insektinficerende ascomyceter anvendt til sammenligning tidligere. Resultaterne af denne analyse er afbildet i Venn-diagrammet i fig. 4. Af kandidatmanipulationsgenene syntes 78% at være ortologer af gener, der er til stede i alle de andre tre artsområder (dvs. 423 klynger, fig. 4). Dette indebærer, at generne, der udtrykkes under manipuleret bidning induceret af O. kimflemingiae, sandsynligvis ikke er specifikke for manipulation. Blandt disse bredt delte gener var CYPer og andre oxidationsreduktionsrelaterede funktioner overrepræsenterede såvel som gener, der koder for secernerede proteiner og proteaser. Forskellige sekundære stofskiftekommentarer (klynger 7,8 og 9) var også overrepræsenteret blandt disse mere bredt delte ortologiske klynger. De omfattede en tryptophandimethylallyltransferase involveret i ergot alkaloid-syntese, forskellige cytokromer, små secernerede proteiner, en polyketidsyntase (PKS) og en PKS-NRPS (ikke-ribosomalt proteinsyntetase) hybrid. Blandt kandidatmanipulationsgener, der syntes at være unikke for O. kimflemingiae (dvs. 59 klynger, fig. 4), var kun SSPer overrepræsenteret. Imidlertid modtog 92% af disse “unikke” gener ikke en funktionel kommentar. Hvor der blev fundet nogen anden overlapning med de tre artsområder, var SSPer også overrepræsenteret, ligesom større udskillede proteiner. svampe (dvs. 24 klynger, fig. 4), igen fik flertallet (79%) ikke en funktionel kommentar. Blandt de syv orthologe klynger, der var til stede i alle insektinficerende arter, men ikke i andre ascomycetes, fandt vi en formodet, secerneret enterotoksin. Dette enterotoksin var til stede i den bidende opførselsfremkaldende art O. kimflemingiae (to ortologer), O. camponoti-rufipedis (1 ortholog), O. subramanianii sl (to ortologer) og O. australis-Ghana (to ortologer) såvel som i O. australis-Brazil og O. sinensis. Desuden viste en af de to enterotoksinortologer i O. kimflemingiae et dramatisk ekspressionsmønster med et > 3.000 gange op -regulering under manipulation og en 200 gange nedregulering efter18. Dette enterotoksin kan således potentielt være en vigtig nøglespiller i etableringen af adfærdsmanipulation af disse Ophiocordyceps-arter.

Bevaring af sekundære metabolitklynger

En generel hypotese er, at ændrede værtsadfærd etableres gennem sekretion af sekundære metabolitter i tillæg til større bioaktive forbindelser . Denne hypotese understøttes af overrepræsentation af visse annoterede sekundære metabolitklynger blandt gener af O. kimflemingiae, der er opreguleret under manipuleret bidende opførsel18. Undersøgelse af disse nærmere fandt vi, at generne, inden for men også direkte flankerende de kommenterede sekundære metabolitklynger, fulgte dette særlige ekspressionsmønster (fig. 5a). Vi spurgte, om disse klynger var konserveret blandt insektinficerende Ophiocordyceps-svampe. Dette vil antyde en lighed i brugen af sekundære metabolitter af disse svampe til at interagere med deres myrværter for at etablere den observerede manipulerede adfærd. Som sådan undersøgte vi kommenterede klynger 7,8 og 9 af O. kimflemingiae og deres direkte flankerende gener. Disse klynger 1) blev opreguleret under manipuleret bidende adfærd efterfulgt af en betydelig nedregulering og 2) delte ortologer med andre ascomycetes (se ovenfor). Efter generne inden for disse klynger søgte vi efter homologer (BLASTp-tilpasning) og ortologer (ortolog klyngedannelse) i de andre fire antinficerende svampe (fig. 5b og supplerende figur S3). Dette viste, at unilateralis-arterne organiserede i det mindste nogle af deres sekundære metabolisme-relaterede gener i stort set ens klynger. De andre Ophiocordyceps-arter havde homologer og ortologer af disse sekundære metabolismegener spredt over deres genomer eller indeholdt slet ikke en kopi (fig. 5b og supplerende figur S3). For eksempel indeholdt kommenteret klynge 8 i O. kimflemingiae en tryptophandimethylallyltransferase flankeret af oxidationsreduktionsrelaterede CYPer og et gen med et FAD-bindingsdomæne. Denne klynge flankeres direkte af syv gener, der fulgte et lignende ekspressionsmønster (fig. 5a). O. camponoti-rufipedis genomet havde denne tryptophan dimethylallyltransferase på en lignende måde; flankeret af CYPer og et FAD-bindende gen efterfulgt af homologer og ortologer af de tilstødende gener (fig. 5b). O. subramanianii s.l. genom havde også en lignende tryptophandimethylallyltransferase. Det blev imidlertid flankeret af ikke-homologe / ortologe CYP- og FAD-bindende gener. Faktisk O. subramanianii s.l. havde homologer / ortologer af disse gener, men de boede på helt forskellige contigs, ligesom generne lige uden for den annoterede sekundære metabolitklynge (fig. 5b). Desuden havde begge australis-arter ikke et ortologt / homologt gen, der koder for denne særlige tryptophandimethylallyltransferase. Faktisk syntes australis-arten fra Ghana overhovedet ikke at indeholde en formodet tryptophandimethylallyltransferase. Lignende konklusioner kunne drages ved at analysere de andre sekundære metabolitklynger (supplerende figur S3). Klynger 7 og 9 fra O. kimflemingiae syntes stort set sammenlignelige med henholdsvis klynger 31 og 8 fra O. camponoti-rufipedis. Alligevel var gener associeret med disse klynger igen hverken ikke til stede eller spredt over genomerne af de tre andre ant-inficerende arter.

Fylogeni af svampe-enterotoksiner

Gener, der indeholdt et kommenteret enterotoksin-PFAM-domæne (PF01375) og et sekretionssignal blev angivet som formodede, secernerede enterotoksiner. Tidligere resultater og vores nuværende undersøgelse indebærer, at gener, der koder for disse formodede enterotoksiner, er vigtige i opførselsmanipulerende arter af Ophiocordyceps-svampe.Disse udskillede bakterielignende toksiner kan potentielt påvirke myreadfærd ved at forstyrre produktionen af kemo-signalmolekyler i værten. Dette blev demonstreret for enterotoksiner fra bakterielle entomopatogener i kønsferomoner af boldejern 23,24. De kunne dog også fungere som blot dræbende forbindelser25. Derudover var en af disse formodede enterotoksiner ekstremt stærkt opreguleret under kun den manipulerede bidende begivenhed18. Dette særlige gen var til stede i alle antimanipulerende Ophiocordyceps-arter i denne undersøgelse såvel som O. australis-Brazil og O. sinensis. Desuden syntes de antinficerende svampe at have et ret stort antal gener, der koder for disse patogenicitetsrelaterede proteiner. Andre ascomycetes indeholdt generelt enten langt færre (dvs. andre entomopathogener, nematodeinficerende svampe og Magnaporthe oryzae) eller ingen enterotoksindomæneholdige gener (dvs. resten af ascomyceterne i denne undersøgelse). Genomerne fra antinficerende Ophiocordyceps-arter havde 20-36 formodede enterotoksiner med O. australis-Ghana (n = 20) med det mindste og O. kimflemingiae (n = 36) med det største antal. Nematodeinficerende svampe Ophiocordyceps minnesotensis og Drechmeria coniospora indeholdt 19 og 25 gener med et enterotoksin PFAM-domæne. Andre entomopatogener af rækkefølgen Hypocreales indeholdt kun 4–16 enterotoksin-annoteringer, hvor Metarhizium robertsii og Cordyceps bassiana havde flest (henholdsvis n = 16 og n = 14). De andre ascomycete genomer i denne undersøgelse havde ingen enterotoksinkodende gener, bortset fra plantepatogenet M. oryzae, som indeholdt seks.

Vi byggede et fylogenetisk træ baseret på alle svampegener i denne undersøgelse, som indeholdt PF01375 varmelabilt enterotoksin alfa-kæde domæne. Enterotoksiner er for det meste blevet rapporteret for bakteriearter (f.eks. Ref 23,24,25). Vi inkluderede derfor også fire bakterielle enterotoksiner. Dette resulterede i et træ baseret på 252 domæneregioner. Vi bestemte først, hvordan enterotoksinerne fra den bakterielle og planteinficerende art (dvs. M. oryzae) ville klynges i forhold til størstedelen af dyreinficerende arter (dvs. insekt- og nematodeinficerende svampe). Dette placerede tre bakterielle enterotoksiner i en klade og den fjerde i en separat klade (supplerende figur S4). Et bakterielt enterotoksin fra Leptospira mayottensis dannede en udgruppe for den planteinficerende M. oryzae-klade. M. oryzae bor uden for rækkefølgen Hypocreales. Som sådan blev de plantepatogene enterotoksiner fra denne art anvendt som en udgruppe, og træet var rodfæstet på L. mayottensis (supplerende figur S4). Dette træ viste, at nogle enterotoksiner af antinficerende svampe er beslægtede med andre insekt- eller nematodeinficerende arter. Andre enterotoksiner dannede deres egne klader. Inden for disse antinfektionsspecifikke klader blev enterotoksiner fra de to unilateralis-komplekse arter eller australis-komplekse arter ofte parret. Ophiocordyceps subramanianii s.l. enterotoksiner dannede ofte udgruppen til en unilateralis- eller australis-specifik klade (Supplerende figur S4). Derudover var enterotoksinet, der var stærkt opreguleret under manipuleret bidende opførsel (dvs. GeneID Ophio5 | 373 Supplerende figur S4), såvel som konserveret blandt alle antinficerende arter i denne undersøgelse (og O. sinensis, se ovenfor). inden for en klade, der kun indeholdt antimanipulerende arter. Dette indikerer, at dette særlige enterotoksin faktisk kunne være af central betydning for etablering af manipuleret adfærd som observeret hos de arter, der er inkluderet i denne undersøgelse.