Krabi podkovy se někdy nazývají „živé fosilie“, protože existují v nějaké formě již více než 450 milionů let. V této době Země prošel několika významnými dobami ledovými, Velkým umíráním, vznikem a následným rozpadem Pangey a dopadem asteroidů, který znovu zabil dinosaury a většinu života na Zemi. Jinými slovy, krabi podkovy opravdu viděli nějaké hovno.
Domnívám se, že některé z jejich nejpodivnějších zkušeností musely přijít během několika posledních desetiletí jako jeden z savců s měkkým tělem přišlo poté, co dinosauři začali rukama hromadně vybírat podkovy z oceánu. Současní lidé podkovy úmyslně nezabíjejí – stejně jako předchozí století, kdy je farmáři lovili jako hnojivo nebo rybáři, kteří je používali jako návnadu. Místo toho drhnou kraby očistěte od barnacles, sklopte jejich sklopné krunýře a přilepte nerezové oceli el jehly do měkkého, slabého místa, aby bylo možné čerpat krev. Krev podkovy krve teče modře a neprůhledně, jako nemrznoucí směs smíchaná s mlékem.
A k čemu přesně lidé potřebují krev živé fosilie? Dalo by se říci, jakési čarodějnictví, protože doslova udržuje lidi naživu. Krev podkovy je mimořádně citlivá na toxiny z bakterií. Používá se k testování kontaminace při výrobě všeho, co by mohlo proniknout do lidského těla: každý výstřel, každý infuzní roztok a každý implantovaný zdravotnický prostředek.
Moderní biomedicínský průmysl je na této krvi tak závislý, že zmizení krabů z podkovy by ji okamžitě ochromilo. A v posledních letech se krabí podkovy, zejména v Asii, dostaly pod řadu hrozeb: ztráta přirozeného prostředí, protože mořské stěny nahrazují pláže, kde se rozmnožují, znečištění, nadměrný rybolov jako potrava a návnada. Kraby podkovy vykrvené pro biomedicínské použití ve Spojených státech jsou vráceny do oceánu, ale odhadem 50 000 jich také každoročně zemře.
Existuje však i jiný způsob – způsob, jak využívají spíše moderní technologie než krev starodávného zvířete. Syntetická náhražka krve z podkovy je k dispozici již 15 let. Toto je příběh o tom, jak se vědcům v tichosti podařilo překonat miliony let evoluce, a proč to tak dlouho trvalo zbytku světa.
Další příběhy
Jeak Ling Ding říká, že byla „vždy laboratorní krysa“ – druh biologa, který měl na sobě bílé pláště, spíše než druh, který se brodil v bahně. Přesto v polovině 80. let zjistila, že se v bahně svíjela při hledání krabů podkovy. ústí, kde žili, vzpomíná podceňovaným způsobem, „že vůbec vůbec nevoňala.“
Ding spolu s manželem a výzkumem partner Bow Ho, přišel do krabů podkovy vytrvale a jejich konečným cílem bylo, aby zvířata již nebyla nutná pro biomedicínský výzkum. V té době byla molekulární biologkou na Singapurské národní univerzitě a oddělení pro in vitro fertilizaci v nemocnici přišlo za problémem Ding a Ho: Jejich embrya by nepřežila dostatečně dlouho – mohlo by to být kvůli bakteriální kontaminaci ?
V té době – a nyní – je standardním testem LAL, což je zkratka pro limulus amebocyte lyzate. Limulus označuje Limulus polyphemus, druh kraba podkovy původem z atlantického pobřeží Severní Ameriky. Amebocyt označuje buňky v krvi kraba. A lyzát je materiál uvolněný z buněk, jakmile byly „lyžovány“ nebo rozbity. To je látka mimořádně citlivá na bakteriální toxiny.
První osoba, která to zjistila o LAL, byl Frederik Bang. Třicet roky před Dingem – a 9 000 mil daleko na Cape Cod – také on sbíral podkovy kraby na pobřeží. (Z důvodů, které nejsou zcela pochopeny, se krabi podkovy vyskytují pouze kolem východního pobřeží Severní Ameriky a Asie.) Bang, patolog, zajímal se o primitivní imunitní systém tvora. Usadil se na protokolu vstřikování bakterií z mořské vody přímo do krabů podkovy, které způsobují shlukování jejich krve do „strunných mas.“
Bang měl podezření, že toto srážení mělo svůj účel. Imobilizoval bakterie a utěsnil zbytek těla kraba podkovy před napadajícím patogenem. Zajímavé je, že se jejich krev změnila na gelovou, i když nejprve vařil injekci bakterií po dobu pěti nebo 10 minut. To mělo zabít bakterie a sterilizovat injikovaný roztok. Bang si uvědomil, že krev je citlivá nejen na živé bakterie, ale na bakteriální toxiny, které přetrvávají i po sterilizaci.
Lidský imunitní systém může být mnohem propracovanější než krab podkovy, ale také reaguje na tyto toxiny. Lékaři si to poprvé uvědomili na konci 19. století, kdy pacienti, kteří dostali sterilní injekci, přesto upadli do „injekční horečky“ nebo „solného roztoku“. V nejhorších případech mohou toxiny způsobit septický šok nebo dokonce smrt.
V době, kdy společnost Bang prováděla tento výzkum v padesátých letech minulého století, bylo standardním způsobem testování bakteriálních toxinů vstřikování vzorku králíkům. Vyžadovalo to, aby někdo kontroloval teploty králíků každých 30 minut po dobu tří hodin na příznaky horečky, které by naznačovaly bakteriální kontaminaci.
Pod Mikroskop měl králičí krvinky také tendenci se shlukovat kolem toxinu, což si podobnost Bang všiml ve své knize z roku 1956 o krvi z podkovy. Během příštího desetiletí a on a mladý patolog Jack Levin vymysleli standardizovaný způsob extrakce LAL. Teprve v roce 1977 však Správa potravin a léčiv umožnila farmaceutickým společnostem nahradit jejich velké kolonie králíků soupravami LAL. Nyní jste jednoduše přidali LAL k testovanému materiálu a převrátili lahvičku, abyste zjistili, zda ztuhla – mnohem rychleji a pohodlněji. Test LAL stále vyžadoval použití zvířat, ale hrozný proces slepování jehel do zvířat se skryl a zadal do jiné části dodavatelského řetězce.
V době, kdy Ding hledal podkovy v Singapuru „Z LAL se stal mnohomilionový průmysl. Jeden litr krve z podkovy má údajně hodnotu až 15 000 $. A soupravy LAL, které potřebovala k testování kontaminace embryí IVF, byly příliš drahé. Vzpomíná si, že jedna souprava pro ni v Singapuru stála 1 000 $.
Proto uvažovala o výrobě vlastního lyzátu. Ale druh krabů podkovy, který studovala v Singapuru, Carcinoscorpius rotundicauda, je mnohem menší než kraby podkovy v Atlantiku a bez smrti by jim nebylo možné nic vykrvácet. Ding se tedy rozhodl vytvořit alternativu k LAL, která by nakonec vůbec nevyžadovala kraby podkovy.
To, co by vyžadovalo, byla manipulace s DNA. Její myšlenkou bylo spojit gen z podkovy odpovědný za schopnost lovu toxinů LAL do buněk, které snadno rostou v laboratoři, jako jsou kvasinky. Biotechnologie jako pole se již pohybovalo směrem k rekombinantní DNA, což znamená odebrat DNA z jednoho druhu a dát ho jinému. O několik let dříve, v roce 1982, začala Eli Lilly prodávat lidský inzulín pěstovaný v nádobách s bakteriemi.
Ding měla dobrý výchozí bod pro svou alternativu LAL. Do té doby vědci identifikovali faktor C, specifickou molekulu v LAL, která detekuje bakteriální toxiny. Začala tedy lovit gen, který tvoří faktor C. Její výzkumný tým vzal buňky z krabů podkovy, které shromáždili, a vykrvil je minimálně. (Také se pokusili, ale nepodařilo se jim, pěstovat podkovy v laboratoři a chovat je pomocí IVF.)
Citlivost kraba podkovy na bakteriální toxiny bohužel také dělal to bolest studovat. Ukázalo se, že toxiny jsou všude – ve vodě, ve zkumavkách, v Petriho miskách. „Veškeré pekařské sklo musíte péct na 200 až 220 stupňů několik hodin.“ říká Ding. Museli také koupit speciální vodu, která byla ošetřena tak, aby neobsahovala bakteriální toxiny. Pokud jste nebyli opatrní, mohla by se vaše tuba s roztokem snadno proměnit na gel.
Když Ding a Ho konečně zjistili gen pro faktor C, spojili jej do kvasinek. To se nezdařilo, protože zatímco kvasinky vyráběly faktor C, nevylučovaly molekulu. “Kvasinky bylo velmi těžké rozlomit. Bylo to velmi nečisté a špinavé, “říká. Vyzkoušeli jiný typ kvasinek a savčích buněk – i ty selhaly. Na konci 90. let se Ding a Ho zúčastnili kurzu ve Spojených státech a dozvěděli se o vektorových systémech baculovirů. Zde se virus používá k vložení faktoru C do buněk střevního hmyzu a přemění je na malou továrnu na molekulu. Hmyz a podkovy mají společnou evoluční linii: oba jsou členovci. A tyto buňky fungovaly úžasně.
A konečně, deset let a půl poté, co začala, měla Ding alternativu k LAL, která fungovala bez dalšího poškození krabi podkovy. Zavřela se do knihovny, aby studovala patenty, a sama napsala žádost. Pak to poslala pryč a čekala, až se svět změní.
Svět se nezměnil, alespoň ne pro podkovy. Trvalo tři roky, než v roce 2003 vyšla první testovací souprava rekombinantního faktoru C založená na Dingově patentu, ale i tak farmaceutické společnosti projevily malý zájem.
Společnosti měly řadu důvodů. Byl pouze jeden dodavatel soupravy, společnost, která je dnes součástí švýcarské chemické společnosti Lonza. Farmaceutické společnosti si dávaly pozor, aby se při tak důležité části své výroby nespoléhaly na jediný zdroj. Co kdyby se Lonze něco stalo?Nebo do jejího výrobního závodu zasáhla přírodní katastrofa? Společnosti, které vykrvácejí kraby, také přijdou o spoustu peněz, pokud se faktor C stane široce přijatým. Ze šesti společností se zařízeními pro krvácení krabů ve Spojených státech dva odmítly rozhovory, jedna neodpověděla na žádost o rozhovor a dvě nemají prakticky žádnou veřejnou přítomnost. Šestou je Lonza, která v současné době prodává jak LAL, tak rekombinantní faktor.
Lonza za svou vinu označila pomalé zavádění předpisů. Ve Spojených státech FDA říká společnostem provádějícím testy na bakteriální toxiny, aby postupovaly podle lékopisu Spojených států, příručky, která stanoví drogové standardy. V pokynech z roku 2012 FDA uvedla, že společnosti mohou použít rekombinantní faktor C, který se ve lékopisu neobjevuje, pokud provedou vlastní validační testy. „Riziko samozřejmě spočívá v tom, že FDA nemusí akceptovat vaše ověření a nemůžete svůj produkt uvést na trh,“ říká mluvčí společnosti Lonza Katrin Hoeck. „Farmaceutické společnosti jsou proti riziku.“ Trvalo několik desetiletí, než se průmysl přesunul z králíků do LAL.
Realita podnikání byla pro Ding skutečným zklamáním. „Byli jsme stejně horliví jako vědci, tak šťastní, že to funguje,“ říká. „A mysleli jsme si, že rekombinantní faktor C bude přijat po celém světě a krab podkovy bude zachráněn.“
V poslední době však několik věcí změnilo nedávný počet rizik a výnosů pro farmaceutické společnosti. Lonza již není jediným dodavatelem. V roce 2013 se společnost Hyglos stala druhou společností vyrábějící rekombinantní faktor C. Kevin Williams, vedoucí vědecký pracovník společnosti Hyglos, říká, že to považuje za dlouho očekávanou modernizaci: Farmaceutické společnosti se přestaly spoléhat na prasata a před desítkami let začaly vyrábět inzulín v kvasinkách a bakteriálních buňkách. Proč nelze použít stejnou technologii i na samotný test používaný k ověření, zda je inzulin bezpečný pro injekce?
Z hlediska regulace přidal Evropský lékopis rekombinantní faktor C jako přijatelný test na bakteriální toxiny 2016, připravuje půdu pro změnu ve Spojených státech. Řada farmaceutických společností, zejména Eli Lilly, srovnávala účinnost rekombinantního faktoru C a LAL.
Jay Bolden, odborník na bakteriální detekce toxinů v Eli Lilly, připomíná Lonzu, která přišla do svých laboratoří se sadou rekombinantního faktoru C před více než deseti lety. Tehdy ho to zaujalo, ale ještě nebyl ochoten se ponořit. Zlom nastal v roce 2013, kdy Eli Lilly začala plánovat závod na výrobu inzulínu v Číně, kde původní druh podkovy klesal. „Slyšeli byste někdy, že by se krab podkovy mohl omezit,“ říká Bolden. Naproti tomu dodavatelský řetězec pro rekombinantní faktor C vypadal bezpečněji, a to jak u dodavatelů Hyglos, tak Lonza. LAL a faktor C jsou také srovnatelné z hlediska nákladů.
Bolden říká, že Eli Lilly se rozhodla „nakreslit čáru v písku“: Všechny nové produkty by po určitém okamžiku byly testovány s rekombinantním faktorem C. Společnost nedávno předložila FDA svou první žádost o lék— galcanezumab k prevenci migrén – kde bude finální léčivo testováno na kvalitě s faktorem C. Rovněž se zabývalo použitím rekombinantního faktoru C během výrobního procesu k testování vody a zařízení, což v současné době představuje velkou většinu použití LAL. Bolden říká, že Eli Lilly lobuje v americkém lékopisu, aby zahrnoval rekombinantní faktor C.
Ve čtvrtek bude Bolden hovořit v Cape May v New Jersey na akci pořádané společností Revive & Restore, nezisková organizace, která je nejlépe známá pro svou práci na znovuzrození vyhynulých druhů. „Naším posláním je využívat biotechnologie k ochraně,“ říká Ryan Phelan, spoluzakladatel a výkonný ředitel společnosti Revive & Restore. Phelan se poprvé setkala s Dingem, když cestovala do Singapuru kvůli syntetickému konference o biologii v roce 2017 a realizovala svůj výzkum rekombinantního faktoru C dokonale zapadajícího do křižovatky ochrany a biotechnologie.
Revive & Společnost Restore a její partneři v oblasti ochrany – New Jersey Audubon, American Littoral Society a Delaware River Keeper Network – si vybrali místo Cape May, protože krabí podkovy sem přicházejí každé jaro, aby se rozmnožily. Podkovu už chytat nemůžete. krabi kvůli jejich důležitosti pro ohrožený druh stěhovavých ptáků zvaný červený uzel. Tito ptáci se zde také objevují na jaře. Jejich migrace je načasována tak, aby se ptáci létající z Jižní Ameriky do Arktidy mohli propašovat po kaviáru vejce z podkovy. Pláže zčernají krabi, to ona Cvakání cvaká, jak se ženy házejí snášet vajíčka a samci je oplodňují.Červené uzly se rvačky nají. Na cestu do Arktidy téměř zdvojnásobili váhu.
Jedná se o starodávnou synchronizaci mezi druhy, která začala dlouho předtím, než lidé začali sbírat podkovy pro krev a doufejme, že vydrží dlouho poté.