Antimikrobní genomy Ophiocordycepsu odhalují vysokou rozmanitost potenciálních genů pro manipulaci s chováním a možnou hlavní roli pro enterotoxiny

Vlastnosti genomu

Ophiocordyceps koncept genomů generovaných v této studii (Tabulka 1) byly sestaveny s odečty generovanými napříč různými sekvenčními běhy pomocí dvou typů DNA knihoven. K montáži byly použity pouze běhy, které vedly k vysoce kvalitním čtením (viz Materiály a metody). Sestavení Contig vedlo k velikosti genomu v rozmezí od 21,91 do 23,92 milionů párů bází (Mbp) pro O. unilateralis s.l. a O. australis s.l. druh. Naproti tomu O. subramanianii s.l. měl odhadovanou velikost genomu 32,31 Mb. Genová predikce poskytla u druhů O. unilateralis a O. australis 7 761 až 8 629 genů. Ophiocordyceps subramanianii s.l. se předpokládalo, že bude mít 11 275 genů. Obsah GC v O. subramanianii s.l. (tj. 60,35%) bylo mnohem vyšší ve srovnání s ostatními druhy Ophiocordyceps v této studii (54,66% + / – 1,57%) (tabulka 1).

Rovněž jsme vylepšili sestavení a predikci genů dříve publikovaného genomu O. unilateralis sl kmen SC16a (doplňková tabulka S1), který nyní získal druhové jméno O. kimflemingiae 20. Kromě toho, že je méně fragmentovaný, je nová sestava menší, než se dříve uvádělo18. To je pravděpodobně způsobeno lepším uspořádáním opakujících se oblastí, které byly v této studii nalezeny nejvyšší u druhů unilateralis (6,59–6,83%) ve srovnání s jinými druhy infikujícími mravence (tabulka 1). Navzdory menší velikosti sestavy nová predikce genu zvýšila počet genů se 798 geny. Toto zvýšení je způsobeno především predikcí menšího počtu chimér (tj. Sousedních genů, které jsou nesprávně sloučeny do jednoho modelu genu) pomocí kanálu Braker1 (data nejsou uvedena).

Pro všechny genomy kromě jednoho generované v v této studii byla predikce genu informována čtením RNA-Seq. U dříve hlášeného severoamerického druhu unilateralis O. kimflemingiae byla použita čtení generovaná v této dřívější studii18. Prostřednictvím potíží s kultivací brazilského O. camponoti-rufipedis nebylo získáno dostatek materiálu pro generování dat RNA-Seq kromě čtení DNA potřebných k získání konceptu genomu. Protože jak O. kimflemingiae, tak O. camponoti-rufipedis žijí ve stejném komplexu druhů (unilateralis), pokusili jsme se zmapovat severoamerický druh unilateralis, který čte genom O. camponoti-rufipedis, abychom zjistili, zda je lze použít k informování anotace. Zatímco však 93% čtení O. kimflemingiae mapovaných na svůj vlastní genom, pouze 43% mapovaných na genom O. camponoti-rufipedis (doplňková tabulka S2). Čtení jsme navíc mapovali na další publikovanou O. unilateralis s.l. genomu, který obsahuje O. polyrhachis-furcata 22, k určení, zda by šlo o obecnější efekt křížového mapování nebo specifický pro genom O. camponoti-rufipedis. Výsledkem bylo podobné mapování 41%. To naznačuje, že druhy unilateralis mohou být obecně velmi vzdálené, což činí křížové mapování méně vhodným pro anotaci informací. Pro informativní účely jsme také vzájemně mapovali druhy australis (kmeny MAP-64 z Brazílie a 1348a z Ghany). To mělo za následek 71% a 82% křížově mapovaných čtení oproti 86% a 97% mapovaných na jejich vlastní genomy (doplňková tabulka S2). To znamená, že druhy v komplexu australis jsou tedy pravděpodobně mnohem těsněji příbuzné druhům než druhy v komplexu unilateralis.

Ortologické shluky

Vydali jsme se prozkoumat, které genové předpovědi druhy infikující mravence Ophiocordyceps v této studii jsou pravděpodobně konzervované a sdílené s jinými ascomycety. Kromě toho jsme se zaměřili na objevení toho, jaké druhové a „manipulačně specifické“ specializace se mohly uskutečnit. Předvídané proteomy našich pěti hub infikujících mravence byly porovnány s proteiny 18 dalších houževnatých hub. byli zvířecí paraziti (dva infikující savci, dva infikující hlístice a šest infikujících hmyzu) a 13 pobývá ve stejném pořadí (Hypocreales). Čtyři druhy patřily do stejné rodiny (Ophiocordycipitaceae) a dva byly ve stejném rodu (Ophiocordyceps). fylogenetická rekonstrukce založená na 67 konzervovaných genech přítomných v každém z těchto organismů je znázorněna na obr. 2.

Celkem 51 012 ortologických shluků obsahovalo všechny anotované proteiny každého z 23 askomycetů zahrnutých do této analýzy (doplňková data S1). Souhrnné statistiky týkající se tohoto shlukování lze najít na doplňkovém obrázku S1. Porovnali jsme překrytí ortologických shluků mezi třemi druhy: 1) houby infikující mravence, které zahrnovaly všech pět návrhových genomů generovaných v této studii, 2) ostatní houby infikující hmyz Ophiocordyceps sinensis, Tolypocladium inflatum, oba druhy Metarhizium a oba druhy Cordyceps a 3) všechny ascomycety neinfikující hmyz, které zahrnovaly další infikující zvířata, infikující rostliny, infikující houby a saprofytické houby. Výsledky této analýzy jsou znázorněny na Vennově diagramu z obr. 3a. Následně jsme provedli analýzy obohacení funkčních anotací genů druhů infikujících mravence, které byly nalezeny v různých překrývajících se a nepřekrývajících se částech diagramu. Z 7931 ortologických shluků, které byly nalezeny ve všech třech druzích druhů, byly významně nadměrně zastoupeny anotace genové ontologie (GO) pro obecné biologické procesy. To naznačuje, jak by se dalo očekávat, že askomycety s odlišným životním stylem používají podobné mechanismy pro obecné procesy, jako je transkripce, translace, transport proteinů a signální transdukce. Byly však nedostatečně zastoupeny geny, u nichž se předpokládalo, že kódují (malé) sekretované proteiny, proteiny s anotacemi GO pro procesy a patogenezi více organismů a konkrétněji vylučované domnělé enterotoxiny. Když jsme skutečně provedli analýzu obohacení anotací přítomných v ortologických klastrech, které byly nalezeny pouze u druhů infikujících mravence (tj. 6 672 klastrů, obr. 3a), našli jsme opačný výsledek. GO anotace pro (do značné míry stejné) obecné biologické procesy byly významně nedostatečně zastoupeny, zatímco (malé) vylučované proteiny, proteiny s anotacemi GO pro procesy a patogenezi více organismů a domnělé enterotoxiny byly nadměrně zastoupeny. To naznačuje, že významná část sekretomu houb infikujících mravence v této studii je pro ně specifická. Tato specificita se objevila částečně v důsledku enterotoxinů, které jsou součástí sekretomu, a bioaktivních malých sekretovaných proteinů (SSP), které by mohly být důležité v interakcích mezi houbami a mravenci. (Malé) vylučované proteiny byly také nadměrně zastoupeny mezi klastry, které houby infikující mravence sdílely výlučně buď s jinými entomopatogeny (262 klastrů) nebo ne-entomopatogeny (449 klastrů). To naznačuje, že jejich sekretomy také obsahují obecnější proteiny specifické pro entomopatogen, stejně jako proteiny, které jsou sdíleny výlučně s neentomopatogenními askomycety.

Rovněž jsme zkoumali, jak tyto druhy představují ortologické shluky, které byly nalezeny pouze u hub infikujících mravence (obr. 3b). Z celkového počtu 6 672 klastrů v tomto srovnání se 90,6% jeví jako druhově specifické. Překrývání shluků bylo tedy okrajové, i když všechny druhy v této studii sídlí ve stejném rodu (Ophiocordyceps) a v některých případech dokonce ve stejném komplexu druhů (O. unilateralis s.l. a O. australis s.l.). Analýza obohacení funkčních anotačních termínů v těchto druhově specifických klastrech opět vedla k nadměrné reprezentaci (malých) sekretovaných proteinů. Ačkoli okrajové, většina shluků shluků byla nalezena mezi více příbuznými druhy ve stejném komplexu (tj. O. australis s.l., 289 shluků a O. unilateralis s.l., 182 shluků obr. 3b). Také zde obohacovací analýzy odhalily nadměrné zastoupení (malých) sekretovaných proteinů. Ukazuje se tedy, že statisticky významné množství fungálního sekretomu těchto druhů infikujících mravence je buď komplexně nebo druhově specifické. Kromě toho jsme našli nadměrné zastoupení pojmů GO patogenity mezi komplexně specifickými ortologickými klastry. Toto zjištění lze připsat přítomnosti ortologických enterotoxinů u druhů ve stejném komplexu.Pouze čtyři shluky, které nebyly v našem srovnání přítomny v žádném z dalších ascomycet, byly sdíleny mezi všemi pěti druhy infikujícími mravence (obr. 3b). Žádná z těchto čtyř klastrů neobdržela funkční anotaci, ale tři z nich obsahovaly geny s předpokládanými sekrečními signály. U tří ze čtyř klastrů vedla analýza genů BLASTp proti databázi NCBI pouze k hypotetickým proteinovým zásahům s dříve uloženou verzí genomu O. kimflemingiae18. To naznačuje, že tyto shluky mohou skutečně představovat proteiny, které jsou jedinečné pro druhy infikující mravence Ophiocordyceps. Proteinové sekvence ve čtvrtém klastru vedly k hitům s metaloproteázami navíc k opětovnému sladění s hypotetickým proteinem z O. kimflemingiae (XA68_3159) (doplňková tabulka S3). Tato skupina může tedy obsahovat domnělé metaloproteázy, které se nacházejí pouze v genomech zde zkoumaných druhů hub infikujících mravence. Kromě toho pouze 2 z klastrů nalezených jedinečně v houbách infikujících mravence byly rozděleny mezi všechny čtyři druhy, které vyvolávají kousavé chování (obr. 3b). Analýza BLASTp genů v těchto klastrech opět vyústila v hypotetické proteinové zásahy s dříve uloženou verzí genomu O. kimflemingiae18 (doplňková tabulka S4).

Geny manipulace kandidátů zapojené do stanovení chování kousání

Analyzovali jsme zachování kandidátských genů spojených s manipulovanou kousací událostí pozorovanou u infikovaných mravenců. Použili jsme dříve publikovaná data transkriptomiky18 a znovu jsme určili diferenciální genovou expresi mapováním dat do nové verze genomu O. kimflemingiae. Podle dříve publikované studie jsme se řídili úvahou, že kandidátské geny, zapojené do vytváření manipulovaného kousání, budou během této události up-regulovány a poté rychle znovu down-regulovány. Jako takové bylo identifikováno 547 kandidátských genů, což je o 49 více, než bylo uvedeno v předchozí analýze18. V souladu s dříve uvedenými údaji byly nadměrně zastoupeny geny zapojené do replikace DNA, oxidačně-redukčních procesů, sekrece a sekundárního metabolismu.

Zachování kandidátních manipulačních genů bylo také analyzováno pomocí ortologického shlukování. Porovnávali jsme překrývání ortologických shluků obsahujících ty kandidátské geny, které byly významně up- během a down-regulované po manipulovaném kousacím chování u O. kimflemingiae, se třemi druhy: 1) ostatní antinfekční houby, které zahrnovaly čtyři nový koncept genomy generované v této studii, 2) ostatní houby infikující hmyz a 3) všechny ascomycety neinfikující hmyz použité pro srovnání dříve. Výsledky této analýzy jsou znázorněny ve Vennově diagramu na obr. 4. Z kandidátních manipulačních genů se 78% jeví jako ortology genů přítomných ve všech ostatních třech druzích (tj. 423 shluků, obr. 4). To znamená, že geny exprimované během manipulovaného kousání vyvolaného O. kimflemingiae nejsou pravděpodobně specifické pro manipulaci. Mezi těmito široce sdílenými geny byly nadměrně zastoupeny CYP a další funkce související s oxidací a redukcí, stejně jako geny kódující vylučované proteiny a proteázy. Různé anotace sekundárního metabolismu (shluky 7,8 a 9) byly také nadměrně zastoupeny mezi těmito široce sdílenými ortologickými shluky. Obsahovaly tryptofan-dimethylallyltransferázu zapojenou do syntézy námelových alkaloidů, různé cytochromy, malé sekretované proteiny, polyketid syntázu (PKS) a hybrid PKS-NRPS (neribozomální protein syntetáza). Z kandidátských manipulačních genů, které se ukázaly být jedinečné pro O. kimflemingiae (tj. 59 shluků, obr. 4), byly nadměrně zastoupeny pouze SSP. Avšak 92% z těchto „jedinečných“ genů neobdrželo funkční anotaci. Tam, kde bylo zjištěno jakékoli jiné překrytí tří rozsahů druhů, byly také nadměrně zastoupeny SSP, stejně jako větší vylučované proteiny. Z těch, které jsou přítomny pouze v antinfekci houby (tj. 24 shluků obr. 4), opět většina (79%) neobdržela funkční anotaci. Ze sedmi ortologických shluků, které byly přítomny u všech druhů infikujících hmyz, ale ne u jiných ascomycet, jsme našli domnělý, vylučovaný enterotoxin. Tento enterotoxin byl přítomen u druhů vyvolávajících kousavé chování O. kimflemingiae (dva ortology), O. camponoti-rufipedis (1 ortholog), O. subramanianii sl (dva ortology) a O. australis-Ghana (dva ortology) , stejně jako v O. australis-Brazil a O. sinensis. Kromě toho jeden ze dvou enterotoxinových ortologů v O. kimflemingiae vykazoval dramatický expresní vzorec s > 3 000násobkem -regulace během manipulace a 200násobná regulace dolů po18. Tento enterotoxin by tedy mohl být potenciálně důležitým klíčovým hráčem při zavádění behaviorální manipulace těmito druhy Ophiocordyceps.

Zachování klastrů sekundárních metabolitů

Obecná hypotéza spočívá v tom, že kromě větších bioaktivních sloučenin se kromě sekundárních metabolitů kromě sekundárních metabolitů stanoví i změněné chování hostitele. . Tuto hypotézu podporuje nadměrné zastoupení určitých anotovaných klastrů sekundárních metabolitů mezi geny O. kimflemingiae, které jsou během manipulovaného kousání chovány18. Při bližším zkoumání jsme zjistili, že geny skutečně uvnitř, ale také přímo obklopují anotované klastry sekundárních metabolitů, sledovaly tento konkrétní vzor exprese (obr. 5a). Zeptali jsme se, zda jsou tyto shluky konzervovány mezi houbami Ophiocordyceps infikujícími hmyz. To by naznačovalo podobnost při použití sekundárních metabolitů těmito houbami k interakci s hostiteli mravenců za účelem stanovení pozorovaného manipulovaného chování. Jako takové jsme zkoumali komentované shluky 7,8 a 9 O. kimflemingiae a jejich přímo sousedící geny. Tyto shluky 1) byly up-regulovány během manipulovaného kousání, po kterém následovala významná down-regulace, a 2) sdílené ortology s jinými ascomycety (viz výše). U genů v těchto shlucích jsme hledali homology (vyrovnání BLASTp) a ortology (ortologické shlukování) u dalších čtyř hub infikujících mravence (obr. 5b a doplňkový obrázek S3). To prokázalo, že druhy unilateralis organizovaly alespoň některé ze svých genů souvisejících se sekundárním metabolismem v převážně podobných shlucích. Ostatní druhy Ophiocordyceps měly homology a ortology těchto sekundárních metabolických genů roztroušených po celém jejich genomu nebo vůbec neobsahovaly kopii (obr. 5b a doplňkový obrázek S3). Například anotovaný klastr 8 v O. kimflemingiae obsahoval tryptofan dimethylallyltransferázu ohraničenou CYP souvisejícími s oxidací a redukcí a gen s vazebnou doménou FAD. Tento shluk je přímo ohraničen sedmi geny, které sledovaly podobný vzor exprese (obr. 5a). Genom O. camponoti-rufipedis měl tuto tryptofan dimethylallyltransferázu podobným způsobem; obklopené CYP a genem vázajícím FAD, následovaným homology a ortology sousedních genů (obr. 5b). O. subramanianii s.l. genom měl také podobnou tryptofan-dimethylallyltransferázu. Bylo však lemováno nehomologními / ortologními geny pro vazbu na CYP a FAD. Ve skutečnosti O. subramanianii s.l. měli homology / ortology těchto genů, ale nacházeli se na zcela odlišných kontigy, stejně jako geny přímo mimo anotovanou skupinu sekundárních metabolitů (obr. 5b). Kromě toho oba druhy australis neměly ortologní / homologní gen kódující tuto konkrétní tryptofan dimethylallyltransferázu. Ve skutečnosti se zdá, že druh australis z Ghany vůbec neobsahuje domnělou tryptofan dimethylallyltransferázu. Podobné závěry lze učinit při analýze ostatních klastrů sekundárních metabolitů (doplňkový obrázek S3). Shluky 7 a 9 z O. kimflemingiae vypadaly do značné míry srovnatelné se shluky 31 a 8 z O. camponoti-rufipedis. Geny spojené s těmito shluky však opět buď nebyly přítomny, nebo byly rozptýleny po genomech tří dalších druhů infikujících mravence.

Fylogeneze fungálních enterotoxinů

Geny, které obsahovaly anotovanou enterotoxinovou PFAM doménu (PF01375) a sekreční signál, byly označeny jako domnělé, vylučované enterotoxiny. Předchozí výsledky a naše současná studie naznačují, že geny kódující tyto domnělé enterotoxiny jsou důležité u druhů hub Ophiocordyceps manipulujících s chováním.Tyto vylučované bakteriální toxiny mohou potenciálně ovlivňovat chování mravenců tím, že interferují s produkcí chemických signálních molekul v hostiteli. To bylo prokázáno u enterotoxinů z bakteriálních entomopatogenů v sexuálních feromonech boll weevils23,24. Mohli by však také fungovat jako pouhé zabíjení sloučenin25. Kromě toho byl jeden z těchto domnělých enterotoxinů extrémně vysoce up-regulován pouze během manipulované bitovací události18. Tento konkrétní gen byl v této studii přítomen u všech druhů Ophiocordyceps, které manipulují s mravenci, a také u O. australis-Brazil a O. sinensis. Navíc se zdá, že houby infikující mravence mají poměrně velké množství genů kódujících tyto proteiny související s patogenitou. Jiné askomycety obecně obsahovaly buď mnohem méně (tj. Jiné entomopatogeny, houby infikující hlístice a Magnaporthe oryzae), nebo žádné geny obsahující enterotoxinovou doménu (tj. Zbytek askomycet v této studii). Genomy druhů infikujících mravence Ophiocordyceps měly 20–36 domnělých enterotoxinů, přičemž O. australis-Ghana (n = 20) měl nejmenší a O. kimflemingiae (n = 36) nejvyšší počet. Houby infikující hlístice Ophiocordyceps minnesotensis a Drechmeria coniospora obsahovaly 19 a 25 genů s enterotoxinovou PFAM doménou. Další entomopatogeny řádu Hypocreales obsahovaly pouze 4–16 anotací enterotoxinu, přičemž nejvíce jich bylo Metarhizium robertsii a Cordyceps bassiana (n = 16, n = 14). Ostatní genomy ascomycete v této studii neměly žádné geny kódující enterotoxin, s výjimkou rostlinného patogenu M. oryzae, který obsahoval šest.

Postavili jsme fylogenetický strom založený na všech houbových genech v této studii, který obsahovala tepelně labilní enterotoxinovou doménu alfa řetězce PF01375. Enterotoxiny byly většinou hlášeny u bakteriálních druhů (např. Odkazy 23,24,25). Proto jsme také zahrnuli čtyři bakteriální enterotoxiny. Výsledkem byl strom založený na 252 regionech domény. Nejprve jsme určili, jak by se enterotoxiny bakteriálních a rostlin infikujících druhů (tj. M. oryzae) shlukovaly s ohledem na většinu druhů infikujících zvířata (tj. Houby infikující hmyz a nematody). To umístilo tři bakteriální enterotoxiny do jednoho kladu a čtvrtý do samostatného kladu (doplňkový obrázek S4). Jeden bakteriální enterotoxin z Leptospira mayottensis vytvořil outgroup pro rostlinu infikující clad M. oryzae. M. oryzae sídlí mimo řád Hypocreales. Jako takové byly rostlinné patogenní enterotoxiny tohoto druhu použity jako outgroup a strom byl zakořeněn na L. mayottensis (doplňkový obrázek S4). Tento strom ukázal, že některé enterotoxiny hub infikujících mravence jsou příbuzné s jinými druhy infikujícími hmyz nebo nematody. Ostatní enterotoxiny si vytvořily vlastní subtypy. V rámci těchto subtypů specifických pro infekci mravenců byly často spárovány enterotoxiny ze dvou komplexních druhů unilateralis nebo z komplexů australis. Ophiocordyceps subramanianii s.l. enterotoxiny často tvořily outgroup k unilateralis nebo australis specifickému kladu (doplňkový obrázek S4). Kromě toho pobýval enterotoxin, který byl vysoce up-regulován během manipulovaného kousání (tj. GeneID Ophio5 | 373 doplňkový obrázek S4), a také konzervovaný mezi všemi druhy infikujícími mravence v této studii (a O. sinensis, viz výše). v kladu, který obsahoval pouze druhy manipulující mravence. To naznačuje, že tento konkrétní enterotoxin může mít skutečně klíčový význam pro stanovení manipulovaného chování, jak je pozorováno u druhů zahrnutých do této studie.